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microRNA-143对小鼠失神经肌肉萎缩中肌纤维的影响

2017-07-25张会娜张蔚然王轶敏刘新峰郭宏丁向彬

天津农学院学报 2017年2期
关键词:后肢腓肠肌肌纤维

张会娜,张蔚然,王轶敏,刘新峰,郭宏,丁向彬

(天津农学院 动物科学与动物医学学院,天津300384)

microRNA-143对小鼠失神经肌肉萎缩中肌纤维的影响

张会娜,张蔚然,王轶敏,刘新峰,郭宏,丁向彬通信作者

(天津农学院 动物科学与动物医学学院,天津300384)

为研究 microRNA-143(miR-143)对小鼠失神经肌肉萎缩中肌纤维的影响,通过对小鼠进行坐骨神经切断术,构建小鼠腓肠肌失神经萎缩模型,并注射miR-143模拟物或miR-143抑制剂,采用实时定量PCR检测miR-143的表达量,比较肌肉湿重和肌纤维直径,研究miR-143对小鼠失神经腓肠肌的调控作用。结果显示:注射 miR-143模拟物的小鼠,其肌纤维直径明显低于对照组,而注射 miR-143抑制剂的小鼠,其失神经腓肠肌组织肌纤维的直径明显高于对照组。结果说明,miR-143对小鼠失神经腓肠肌肌肉萎缩的修复起着一定调节作用。

microRNA-143;小鼠;失神经;肌肉萎缩;肌纤维;腓肠肌

骨骼肌是周围神经系统的靶器官,周围神经具有支配肌肉运动收缩的功能,一方面相应神经元具有营养相应骨骼肌的功能,另一方面相应的神经元又需要依靠骨骼肌为其提供必需营养因子。因此,肌肉的生长、发育及正常的功能维持都有依赖于运动神经的支配和调节。周围神经系统受到损伤后,因神经元不再通过轴浆运输营养给相应骨骼肌纤维,从而使骨骼肌失去神经的支配作用,失去运动收缩功能,逐渐发生萎缩[1]。神经的再生速度缓慢,而骨骼肌再生依赖于支配它的运动神经纤维的存在,所以失神经肌肉的再生比较困难,因此,如何延缓和防止失神经后肌肉萎缩,并尽量保持肌肉正常功能成为目前研究的难题。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度为22 nt、可以抑制mRNA翻译的非编码小分子RNA,具有重要的生物学功能[2]。其作为一类重要的基因表达调控因子,在细胞分裂、增殖、分化和死亡过程中起着重要的调控作用[3-4]。有研究显示,骨骼肌特异性 miRNA(miR-1、miR-133、miR-206等)与失神经后骨骼肌萎缩的调控密切相关[5]。大鼠失神经后,随着时间的延长,miR-1和 miR-133的表达先下降,之后逐渐升高[6]。miRNA在神经损伤修复过程中起着重要作用。有报道称,切断鼠脊神经后,miR-21表达水平升高,而miR-21可促进轴突的生长[7],表明某些miRNA可能对神经损伤具有修复作用。也有研究表明,在注射细胞毒素造成的肌肉损伤模型中,注射miR- 675-3p和miR-675-5p可促进肌损伤的修复[8]。以上研究结果表明,一些miRNA在肌肉损伤的修复过程中发挥了一定调节作用。笔者在前期研究中发现,miR-143对牛骨骼肌卫星细胞的体外增殖分化过程具有调控作用,但miR-143在体内对肌损伤修复是否具有一定的调节作用还不清楚,因此,本研究通过构建小鼠腓肠肌失神经萎缩模型,进一步研究miR-143在体内对小鼠失神经肌肉萎缩中肌纤维的影响,以期为临床治疗失神经萎缩提供参考依据。

1 材料

1.1 试验动物

健康的清洁级小鼠购自天津市奥易得实验用品有限公司。

1.2 试剂

All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit(AOMD-Q020)购自GeneCopoeia;miR-143模拟物、miR-143抑制剂均购自广州锐博生物技术有限公司;Opti-MEM® Medium(31985-070)、TRIzol(15596-108)购自Life Technologies Corporation。

1.3 仪器

Light Cycler® 96实时荧光定量 PCR 仪(LightCycler 96)购自瑞士Roche公司;Leica切片机(RM2235)购自德国Leica公司。

2 方法

2.1 小鼠腓肠肌失神经萎缩模型的建立及 miR-143处理

2.1.1 试验分组

健康小鼠18只,清洁级,体重(30±1)g,均为6周龄,随机分为3组,每组6只小鼠,分组情况如下:

第1组小鼠用来建立失神经腓肠肌萎缩模型,手术后不注射任何试剂。第2、3组小鼠进行失神经后的miR-143表达干预试验,小鼠右后肢作为注射miR-143模拟物和抑制剂侧,第2组右后肢注射混有miR-143模拟物的opti-MEM培养基,第 3组右后肢注射混有 miR-143抑制剂的opti-MEM培养基,两组小鼠左后肢为对照,注射等量 opti-MEM培养基;小鼠饲养时保证充足饲料,每天换水,每周更换清洁的垫料。术前禁食12 h。

2.1.2 小鼠腓肠肌失神经萎缩模型的建立及 miR-143处理

首先对小鼠进行消毒,然后腹腔注射5%的水合氯醛200 mg/kg,待小鼠麻醉后将其固定在手术台上,在无菌环境下进行操作。第1组小鼠从右后肢大腿背侧部平行于股骨切口,钝性分离股二头肌与股外侧肌,进行坐骨神经探查术,暴露坐骨神经,切除距离梨状肌下缘长约3~5 mm的坐骨神经,两断端翻转 180°,防止断端发生接触,然后按照常规外科手术进行分层缝合,左后肢进行坐骨神经探查术后不做手术处理,建立小鼠失神经腓肠肌萎缩模型。另外 2组小鼠均根据第 1组的方法切断两侧后肢坐骨神经,失神经手术后对小鼠的创口进行消毒,2组左后肢均注射100 μL opti-MEM培养基。第2组右后肢注射混有10 nmol miR-143模拟物的100 μL Opti-MEM培养基;第3组右后肢注射混有10 nmol miR-143抑制剂的100 μL Opti-MEM培养基;分3次在术后1、5、9 d进行注射。

2.2 小鼠腓肠肌标本的提取及RNA提取

在术后14 d将试验小鼠进行断颈处死,将其双侧后肢皮肤切开暴露皮下组织,剥离腓肠肌肌膜,取出小鼠完整腓肠肌,然后迅速用电子天平称重,再将腓肠肌分成2份,一份用于组织切片染色,另一份用于RNA提取。

RNA提取时,事先准备好用液氮预冷的研钵,然后将取下的腓肠肌快速转移至研钵中,用研杵快速研磨肌肉组织,边研磨边加入适量液氮,直至研磨成粉末状,加入1 mL Trizol Reagent,使粉末被覆盖,之后继续研磨至结晶状,将得到的RNA样品室温静置,直至样品完全融化,然后将样品转移至EP管中,进行总RNA提取,所有操作按照Invitrogen Trizol说明书进行。

2.3 qRT-PCR检测miR-143在腓肠肌组织中的表达变化

提取的RNA根据反转录试剂盒操作说明进行反转录,获得第一链cDNA后,采用Light Cycler®96进行实时定量PCR扩增反应检测miR-143的表达量变化,引物序列见表 1。反应体系:10 μL2×All-in-OneTM qPCR Mix(SYBR Green fluorescence),2 μL基因特异性的 miRNAs qRT-PCR Primer(2 μmol/L),2 μL Universal Adaptor PCR Primer(2 μmol/L),2 μL First-strand cDNA(5倍稀释),加 ddH2O(RNase/Dnase free)至20 μL。反应条件:95 ℃,10 min;95 ℃,10 s;60 ℃,20 s;72 ℃,15 s,40个循环。5.8 s rRNA作为定量PCR内参。基因相对表达量采用比较Ct值的方法进行分析。

表1 实时定量PCR检测引物序列

2.4 石蜡切片制作及HE染色

2.4.1 固定、水洗

将采集的腓肠肌放入足量的 4%多聚甲醛溶液中固定24 h,保证组织的完整性,水洗过夜。

2.4.2 脱水、透明

将组织块标记并依次放入 70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇中15 min,进行脱水,然后迅速将组织块取出放入二甲苯中,进行透明处理。

2.4.3 浸蜡、包埋

将透明后的组织块放入融化的石蜡中,充分浸蜡2 h,将浸蜡后的组织块置于包埋盒中,将融化的石蜡注入包埋盒中,待石蜡完全凝固,对蜡块进行修整。

2.4.4 切片、展片

将蜡块固定在金属持蜡器上,切片机的厚度调至6 μm。选择腓肠肌肌腹部的位置进行连续切片,速度要均匀,力度要相同;将切好的蜡片轻轻平铺在45 ℃的水面上,待蜡片充分展平后,将蜡片捞到载玻片的中部,沥去水分,置于60 ℃的烤片机上烘烤2 h。

2.4.5 HE染色

将载玻片放入二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)中各3 min透明,然后迅速取出并依次放入无水乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中各30 s进行梯度复水,之后用蒸馏水冲洗3 min;苏木素液染色10 min,流水清洗,然后用1%的盐酸乙醇分化液分色3 s,PBS缓冲液清洗10 min,伊红水溶液染色10 min,蒸馏水清洗;置于95%乙醇(Ⅰ)、95%乙醇(Ⅱ)中各2 s,无水乙醇(Ⅰ)、无水乙醇(Ⅱ)中各30 s梯度脱水,最后置于二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)中各30 s透明,中性树胶封片。

2.5 肌肉相关指标检测

腓肠肌湿重:将腓肠肌取下后立即用电子分析天平称量肌肉湿重。

形态观察:将试验组与对照组 HE染色的切片分别置于显微镜下观察,观察不同处理下肌纤维形态和肌纤维直径等之间是否存在差异。

腓肠肌肌纤维直径的测量:使用 OLYMPUS CellSens Standard 1.6图像采集系统随机测量试验组与对照组经HE染色后,在5个不同视野中共60根肌纤维的直径,计算平均值。

2.6 统计学分析

本试验数据使用SPSS 17.0软件进行分析,数据资料分析以均值±标准差(x±SD)表示,通过t检验比较试验组与对照组的试验差异,P<0.05表示有统计学意义。

3 结果

3.1 失神经对小鼠模型腓肠肌的影响

手术切除坐骨神经建立小鼠失神经腓肠肌萎缩模型,术后观察发现,切除坐骨神经相应侧的后肢丧失运动能力,呈跛行状。miR-143表达量及肌肉湿重和肌纤维直径检测结果见图1。与对照组相比,miR-143在失神经小鼠组织中的表达量极显著下降(P<0.01);失神经腓肠肌湿重极显著降低(P<0.01);失神经腓肠肌与对照组相比,腓肠肌组织颜色较暗,肌纤维明显萎缩,肌纤维直径极显著低于对照组(P<0.01)。结果表明,随着坐骨神经的切断,小鼠腓肠肌出现了明显萎缩。

3.2 miR-143对小鼠失神经肌肉萎缩中肌纤维的影响

试验结果如图2。双侧坐骨神经均被切断,注射了miR-143模拟物的小鼠腓肠肌中miR-143的表达量极显著高于对照组(P<0.01),肌肉湿重略低于对照组,但差异不显著,失神经部位肌纤维直径极显著低于对照组。而注射了miR-143抑制剂的小鼠腓肠肌中miR-143的表达量极显著低于对照组(P<0.01);其肌肉湿重略高于对照组,失神经部位肌纤维直径极显著高于对照组(P<0.01)。结果表明,体内抑制 miR-143的表达可以减缓失神经肌肉的萎缩过程。

图1 失神经小鼠模型腓肠肌miR-143表达及相关指标检测

图2 miR-143模拟物和miR-143抑制剂注射对失神经小鼠模型腓肠肌的影响

4 讨论

失神经肌肉萎缩是一个复杂的过程,神经受到损伤后会有多种蛋白和基因的表达发生改变。周围神经损伤后,骨骼肌会出现肌肉质量下降、肌纤维直径减小等变化,发生萎缩[9-10],进而丧失运动能力。体内蛋白质合成和降解通路的平衡对肌肉质量有着至关重要的影响,若打破蛋白质合成与降解通路之间的平衡,则会导致肌肉的增生或萎缩[11-13]。有研究发现,周围神经损伤导致骨骼肌废用后,肌细胞内蛋白质合成通路遭到抑制,而降解通路被激活,通路之间的平衡遭到破坏,加速了肌肉中蛋白质的降解。研究表明,泛素化蛋白酶水解系统为影响蛋白质降解通路的主要因素,而激活泛素化蛋白酶水解系统会引起肌肉蛋白加速降解,这也是肌肉质量快速丢失的重要原因[14-15]。本试验构建了小鼠腓肠肌失神经萎缩模型,将试验组小鼠坐骨神经切断,结果显示,14 d后,失神经后的小鼠腓肠肌湿重明显发生了改变,肌肉湿重及肌纤维直径极显著地低于正常水平,也证实了以上观点。

骨骼肌失神经性萎缩是因为肌肉失去神经支配后,神经元无法为骨骼肌提供营养因子,导致骨骼肌废用、萎缩,因此骨骼肌失神经性萎缩也称为失营养性萎缩或废用性萎缩,只有使神经重新获得再支配能力,才能有效防止肌肉萎缩。miRNA作为一种非编码RNA,在肌肉的发生、发育和损伤修复中都发挥着重要的作用。有研究发现,抑制miR-351的表达可以促进成肌前体细胞的凋亡,抑制增殖,过表达miR-351可以促进肌前体细胞进入分化状态,抑制凋亡,说明miR-351对肌细胞的增殖与分化发挥着重要作用[16]。此外,miRNAs可通过对靶基因的调控作用参与到特定的信号通路中,促进受损神经的修复与再生。例如,miR-206可通过对 FGFBP1(FGF binding protein 1)蛋白表达的调控作用,影响神经肌肉接头的神经再支配[17]。在笔者之前的研究中,通过注射miR-139 inhibitors后能够显著增加失神经肌肉萎缩部位的肌纤维直径[18]。由此可见,miRNAs在成肌分化和神经形成过程中发挥着重要的调控作用。而失神经肌肉萎缩的修复与再生机制与神经形成和肌细胞的自我更新有着密切的联系。本研究发现,miR-143在失神经腓肠肌中的表达量显著低于正常水平,表明miR-143可能参与了小鼠失神经肌萎缩的过程中的某些生物过程。在本试验中,通过构建小鼠失神经肌萎缩模型,切断小鼠双侧坐骨神经,在一侧注射miR-143模拟物或 miR-143抑制剂,另一侧作为对照,探究miR-143在体内对失神经肌萎缩组织的作用,试验结果表明,注射了miR-143模拟物的腓肠肌组织中miR-143的表达量显著上升,肌纤维直径较对照组显著减小,而注射了miR-143抑制剂的腓肠肌组织中miR-143的表达量显著下降,肌纤维直径较对照组显著增加,说明抑制miR-143的表达能够延缓失神经支配腓肠肌的萎缩。综上所述,本研究认为,miR-143在体内对肌肉的分化发育具有一定的调控作用,抑制miR-143表达可减缓由失神经造成的肌肉萎缩,对肌损伤也有一定程度的修复作用。

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责任编辑:张爱婷

Effect of MicroRNA-143 on Myofiber of Denevated Muscle Atrophy in Mouse

ZHANG Hui-na, ZHANG Wei-ran, WANG Yi-min, LIU Xin-feng, GUO Hong, DING Xiang-binCorrespondingAuthor
(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)

To investigate the effects of microRNA-143(miR-143)on denervated muscle atrophy in mouse,an amyotrophia mouse model of sciatic nerve resection was established, 10 nmol miR-143 mimics or 10 nmol miR-143 inhibitors were injected to denevated gastrocnemius. Then, the expression of miR-143 was detected by qRT-PCR, the wet weight of gastrocnemius and the cross section diameter of the muscle fibers were compared between the atrophying skeletal muscle and control. The results showed that the diameter of myofiber injected with miR-143 mimics was significantly lower than that of control group while the diameter of myofiber injected with miR-143 inhibitors was significantly higher than that of control group. The results suggested that miR-143 played a role in repairing denervated muscle atrophy.

microRNA-143; mouse; denevation; muscle atrophy; muscle fiber; gastrocnemius

P641.131;S152.72

:A

2017-03-28

国家自然科学基金资助项目“牛骨骼肌卫星细胞成肌分化相关miRNAs的鉴定和功能研究”(31201021);国家大学生创新创业训练计划项目(201510061006);天津市“131”创新型人才培养工程第二层次人选资助项目(无编号)

张会娜(1991-),女,河南平顶山人,本科在读,研究方向为动物细胞工程。E-mail:977841573@qq.com。张蔚然(1992-),男,山东平度人,硕士在读,研究方向为动物细胞与转基因工程。E-mail:zhangweiran1992@sina.com。张会娜和张蔚然对本文具有同等贡献,为并列第一作者。

丁向彬(1978-),男,河南南阳人,副教授,博士,研究方向为动物胚胎工程与繁殖生物技术。E-mail:xiangbinding@163.com。

1008-5394(2017)02-0039-05

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