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温度和光照对浮游植物叶绿素a提取的影响

2017-07-25曹鑫盛武君君孙成渤通信作者

天津农学院学报 2017年2期
关键词:光度法常温分光

曹鑫盛,武君君,孙成渤,通信作者

(1. 天津农学院 国家实验教学示范中心,水产生态与养殖重点实验室,天津 300384;2. 上海四鳃鲈水产科技发展有限公司,上海200433)

温度和光照对浮游植物叶绿素a提取的影响

曹鑫盛1,武君君2,孙成渤1,通信作者

(1. 天津农学院 国家实验教学示范中心,水产生态与养殖重点实验室,天津 300384;2. 上海四鳃鲈水产科技发展有限公司,上海200433)

采用分光光度法测定浮游植物中叶绿素a的含量,研究光照和温度对提取浮游植物叶绿素a的影响,以确定提取浮游植物叶绿素a的最佳条件。在抽滤过程中严格避光,并用冰水混合物冷却至0 ℃保存,抽滤水样。浸提分为避光(低于200 lx)冷藏(-1~1 ℃)组、光照(1 100~1 700 lx)冷藏(-1~1 ℃)组、避光(低于 200 lx)常温(26~30 ℃)组和光照(1 100~1 700 lx)常温(26~30 ℃)组,每组放入10 mL丙酮溶液(90%)浸提19 h。4组平均提取量分别为:避光冷藏组155.73 μg/L;光照冷藏组136.24 μg/L;避光常温组116.67 μg/L;光照常温组89.85 μg/L。结果表明浮游植物叶绿素a的最佳提取条件为冷藏、避光。

叶绿素a;浸提;温度;光照

叶绿素 a是水体初级生产力的重要指标,测定叶绿素 a可以了解水体的生产力和富营养化水平,是水质监测的常规项目。但叶绿素 a并不稳定,它在高温或有光的条件下易发生降解,影响测定结果。浮游植物叶绿素 a的测定方法有分光光度法[1]、荧光法[2]和高效液相色谱法[3]。荧光法具有高效、灵敏的优点,高效液相色谱法可以同时测定多种色素,所得结果更能准确反映浮游植物的生物量,但两种方法所需仪器价格昂贵,操作复杂,难以作为常规的监测方法。一般将GB17378.7—2007[4]中的可见分光光度法作为常规监测方法,规范中采用90%的丙酮溶液作为溶剂,通过浸提,提取叶绿素a。因免去研磨过程,所以该方法方便、安全,且误差较小。GB17378.7—2007中未提出影响浸提过程的相关因子,但试验数据表明,温度和光照直接影响浮游植物叶绿素 a含量的测定结果,这一点与相关研究相近[5]。本试验采用 GB17378.7—2007可见分光光度法检测浮游植物叶绿素a,对影响浸提过程中的主要因子(温度和光照)引起的误差进行对比试验,探究减少浸提过程中浮游植物叶绿素a降解的方法。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

孔径0.45 μm的醋酸纤维滤膜;2.5 L有机玻璃采水器;M50型砂芯过滤装置;LD4-2A离心机;2XZ型旋片式真空泵;721分光光度计;医用冷藏冷冻箱;TES-1334A照度计;10 mL塑料离心管;BS124S电子分析天平。

1.2 采样点

设天津市杨柳青子牙河西河闸段A、B两点,采集A、B两点断面混合样(图1)。

图1 子牙河西河闸段采样点示意图

1.3 方法

1.3.1 研究方法

按照GB17378.7—2007规定,用2.5 L有机玻璃采水器在子牙河西河闸段采集水面至水下 1.2 m的混合水样,在每升水样中加入1 mL碳酸镁溶液(10 mg/L)并混匀,将水样在避光条件下运至实验室,参照有关研究方法[6-8],结合采样点情况,确定抽滤水样体积为250 mL[9],使用M50型砂芯过滤装置及孔径 0.45 μm的醋酸纤维滤膜进行抽滤。将抽滤后得到的水样分为4组(表1)(每组设置 2个平行样),每组加入 10 mL丙酮溶液(90%),在10 mL塑料离心管中浸提19 h。再将浸提后的提取液使用 LD4-2A离心机以 3 500 r/min的转速离心。最后使用721分光光度计分别依次在750、664、647、630 nm波长处对离心后提取液的上清液测定吸光值,并使用计算方法中“1.3.2.1叶绿素a分光光度法计算”进行叶绿素a含量的计算,计算每组平行水样的平均值。

表1 抽滤后水样的4组浸提条件

4组水样均浸提19 h,浸提过程中振摇1~2次,以减小因溶剂分布不均造成的误差。

1.3.2 计算方法

1.3.2.1 叶绿素a分光光度法计算

将各组提取液经离心后的上清液在664、647、630 nm波长下测得的吸光值,减去其在750 nm波长下测得的吸光值,得到校正后的吸光值 E664、E647、E630,再按公式(1)计算叶绿素a的含量。

式中:ρ(chl-a)为样品中叶绿素a含量,单位:μg/L;V为水样品实际用量,单位:L;L为测定池光程,单位:cm;u为样品提取液体积,单位:mL。

1.3.2.2 标准差

1.3.2.3 变异系数

式中:S为标准差值;X为数据的算术平均值;CV为变异系数。

2 结果与分析

不同浸提条件对叶绿素 a的提取量有显著影响(图2)。冷藏(-1~1 ℃)组提取的叶绿素 a含量显著高于常温(26~30 ℃)组。常温(26~30 ℃)组叶绿素a的浸提易受天气状况影响,所得数据波动较大。因此,叶绿素 a的浸提过程是否具备冷藏条件,很大程度上影响着提取结果的准确性。

4个试验组中,叶绿素a的提取量存在显著差异(P<0.01)。根据图2与表2,3分析,4个试验组叶绿素 a的提取量从多到少依次为:避光冷藏组>光照冷藏组>避光常温组>光照常温组,说明无论是常温还是冷藏,光照条件下叶绿素 a的降解较快,避光条件下叶绿素a分解相对较慢[5-10],且在单因素条件下,温度要比光照对叶绿素 a的降解影响更加显著。

图2 不同提取方法测定样本叶绿素a含量结果

表2 A、B点光照与避光条件下温度对叶绿素a提取效果的影响

表3 A、B点冷藏与常温条件下光照对叶绿素a提取效果的影响

3 讨论

3.1 光照和温度对叶绿素a提取量的影响

张武昌等研究了温度和光照对叶绿素 a的降解速率的影响[5],得出了叶绿素a在不同光照条件及不同温度的黑暗条件下的降解规律。本研究中,避光(低于200 lx)常温(26~30 ℃)组与光照(1 100~1 700 lx)常温(26~30 ℃)组叶绿素a的提取量平均变异系数为27.26%(避光常温组平均提取量高于光照常温组),避光(低于200 lx)冷藏(-1~1 ℃)组与光照(1 100~17 00 lx)冷藏(-1~1 ℃)组叶绿素 a的提取量平均变异系数为11.30%,表明叶绿素a的光降解速率在常温(26~30 ℃)条件下明显快于冷藏(-1~1 ℃)条件。本试验结果与张武昌等[5]的研究结果对应,但由于所研究的温度条件不同,故无法进行数据的比较。

由表2,3可知,避光冷藏组与光照冷藏组叶绿素a提取量的平均变异系数为11.30%(避光冷藏组平均提取量高于光照冷藏组),避光冷藏组与避光常温组叶绿素 a提取量的平均变异系数为27.84%(避光冷藏组平均提取量高于避光常温组),说明在浸提过程中,光照条件对提取效果的影响小于温度,本项对比补充了张武昌等[5]关于温度和光照对叶绿素 a降解速率影响研究中未涉及的方面。

3.2 其他测定条件对叶绿素a降解速率的影响

叶绿素 a的降解可分为暗降解和光降解,根据张武昌等[5]研究表明,光照和温度影响叶绿素a的降解,在-20 ℃条件下,叶绿素 a在黑暗中几乎不降解,在15 ℃条件下,叶绿素a光降解的速度非常快,而暗降解的速度则较慢。

本试验每次离心时间为10 min,叶绿素a在离心过程中降解率为0.02%;抽滤时间为90 min,叶绿素a在抽滤过程中降解率为0.18%。因此,在室温且避光的条件下,离心和抽滤过程中叶绿素a的降解量非常低。

参照 GB17378.7—2007中的方法,结合实际操作过程,注意水样在加入碳酸镁(10 g/L)溶液后,要置于黑暗环境中保存,如需转移,其转移过程也要求严格避光。抽滤过程中,由于抽滤液的体积和浓度不同,造成抽滤时间的不一致,以及抽滤过程中环境光照强度的变化会影响测定结果,所以抽滤过程也应严格避光。水样移入比色皿后,应尽快完成测定,以减少叶绿素 a的光降解。根据周静等[11]研究表明,叶绿素a浸提过程如果采用塑料材质(丙酮对塑料具有腐蚀作用)的离心管作为容器或者冷藏时间过长,测定浮游植物叶绿素a 的提取量都会偏大。

4 结论

对比各试验组叶绿素 a的提取结果、水样的保存、抽滤及浸提过程,冷藏(-1~1 ℃)和避光(光照低于 200 lx)条件下浮游植物叶绿素 a的提取量最大(平均提取量155.73 μg/L)。若浸提不能满足避光(光照低于200 lx)条件,也必须满足冷藏(-1~1 ℃)要求,这样才能获得相对精准有效的叶绿素a浸提数据。

[1] 王玉芳,杨士斌,刘得银,等. 浮游植物叶绿素a含量不同方法测定比较-以白洋淀区域水体为例[J]. 水文,2014,34(5):57-60.

[2] Yentsch C S,Menzel D W. A method or the determination of phytoplankton chlorophyll and phaeophytin by fluorescene[J].Deep Sea Research,1963,10:221-231.

[3] Schmid H,Bauer F,Stich H. Determination of algal biomass with HPLC pigment analysis from lakes of different trophic state in comparison to microscopically measured biomass[J].Journal of Plankton Research,1998,20:1651-1661.

[4] 国家标准化管理委员会. 海洋监测规范:第7部分:GB17378.7—2007[S]. 北京:中国标准出版社,2008.

[5] 张武昌,王荣. 光和温度对叶绿素a和脱镁叶绿酸a降解的影响[J]. 海洋科学,2000,2(4):50-52.

[6] 刘丽雪,王玉珏,邸宝平,等. 2012年春季渤海中部及邻近海域叶绿素a与环境因子的分布特征[J]. 海洋科学,2014,38(12):8-15.

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责任编辑:张爱婷

Effective of Temperature and Illumination on Extraction of Chlorophyll a in Phytoplankton

CAO Xin-sheng1, WU Jun-jun2, SUN Cheng-bo1,CorrespondingAuthor
(1. National Experimental Teaching Demonstration Center of Aquatic Ecology and Breeding Key Laboratory, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Shanghai Sisailu Aquatic Science & Technology Development Co. Ltd,Shanghai 200433, China)

The spectrophotometric method in different conditions of light and temperature, extraction of phytoplankton chlorophyll a determined, to study the different illumination and temperature on the extraction of phytoplankton chlorophyll a and determine phytoplankton chlorophyll a in the optimum conditions of extraction. Strictly avoid light in the filtration process,and use the ice water mixture is cooled to 0 ℃ preservation, water filtration. Leaching provided to avoid light(less than 200 lx refrigerated(-1-1 ℃)group, light(1 100-1 700 lx)cold(-1-1 ℃)group, evades the light(less than 200 lx)at room temperature(26-30 ℃)group and light(1 100-1 700 lx)at room temperature(26-30 ℃)group, each group into the 90% acetone solution extraction 19 h. The average extraction amounts of the four groups were as follows: 155.73 μg/L of the cold storage group and 136.24 μg/L in the light cold storage group, 116.67 μg/L in the ambient temperature group and 89.85 μg/L in the normal temperature group. The results showed that the optimal extraction conditions of phytoplankton chlorophyll a were cold storage and light avoidance.

chlorophyll a; extraction; temperature; illumination

X832

:A

2016-03-08

国家星火计划项目“水产品健康养殖、加工与质量安全控制产业化示范——南美白对虾健康养殖技术示范与推广”(S2011A100020)

曹鑫盛(1993-),男,广西桂林人,本科在读,主要从事水产科学方面的研究。E-mail:wamlybh@163.com。

孙成渤(1957-),男,山东长岛人,教授,学士,主要从事水生生物学和养殖水域生态系统修复技术的研究。E-mail:sunchengbo2003@sohu.com。

1008-5394(2017)02-0049-04

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