温度和光照对浮游植物叶绿素a提取的影响

曹鑫盛，武君君，孙成渤，通信作者

（1. 天津农学院 国家实验教学示范中心，水产生态与养殖重点实验室，天津 300384；2. 上海四鳃鲈水产科技发展有限公司，上海200433）

温度和光照对浮游植物叶绿素a提取的影响

曹鑫盛1，武君君2，孙成渤1，通信作者

（1. 天津农学院 国家实验教学示范中心，水产生态与养殖重点实验室，天津 300384；2. 上海四鳃鲈水产科技发展有限公司，上海200433）

采用分光光度法测定浮游植物中叶绿素a的含量，研究光照和温度对提取浮游植物叶绿素a的影响，以确定提取浮游植物叶绿素a的最佳条件。在抽滤过程中严格避光，并用冰水混合物冷却至0 ℃保存，抽滤水样。浸提分为避光（低于200 lx）冷藏（-1～1 ℃）组、光照（1 100～1 700 lx）冷藏（-1～1 ℃）组、避光（低于 200 lx）常温（26～30 ℃）组和光照（1 100～1 700 lx）常温（26～30 ℃）组，每组放入10 mL丙酮溶液（90%）浸提19 h。4组平均提取量分别为：避光冷藏组155.73 μg/L；光照冷藏组136.24 μg/L；避光常温组116.67 μg/L；光照常温组89.85 μg/L。结果表明浮游植物叶绿素a的最佳提取条件为冷藏、避光。

叶绿素a；浸提；温度；光照

叶绿素 a是水体初级生产力的重要指标，测定叶绿素 a可以了解水体的生产力和富营养化水平，是水质监测的常规项目。但叶绿素 a并不稳定，它在高温或有光的条件下易发生降解，影响测定结果。浮游植物叶绿素 a的测定方法有分光光度法[1]、荧光法[2]和高效液相色谱法[3]。荧光法具有高效、灵敏的优点，高效液相色谱法可以同时测定多种色素，所得结果更能准确反映浮游植物的生物量，但两种方法所需仪器价格昂贵，操作复杂，难以作为常规的监测方法。一般将GB17378.7—2007[4]中的可见分光光度法作为常规监测方法，规范中采用90%的丙酮溶液作为溶剂，通过浸提，提取叶绿素a。因免去研磨过程，所以该方法方便、安全，且误差较小。GB17378.7—2007中未提出影响浸提过程的相关因子，但试验数据表明，温度和光照直接影响浮游植物叶绿素 a含量的测定结果，这一点与相关研究相近[5]。本试验采用 GB17378.7—2007可见分光光度法检测浮游植物叶绿素a，对影响浸提过程中的主要因子（温度和光照）引起的误差进行对比试验，探究减少浸提过程中浮游植物叶绿素a降解的方法。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

孔径0.45 μm的醋酸纤维滤膜；2.5 L有机玻璃采水器；M50型砂芯过滤装置；LD4-2A离心机；2XZ型旋片式真空泵；721分光光度计；医用冷藏冷冻箱；TES-1334A照度计；10 mL塑料离心管；BS124S电子分析天平。

1.2 采样点

设天津市杨柳青子牙河西河闸段A、B两点，采集A、B两点断面混合样（图1）。

图1 子牙河西河闸段采样点示意图

1.3 方法

1.3.1 研究方法

按照GB17378.7—2007规定，用2.5 L有机玻璃采水器在子牙河西河闸段采集水面至水下 1.2 m的混合水样，在每升水样中加入1 mL碳酸镁溶液（10 mg/L）并混匀，将水样在避光条件下运至实验室，参照有关研究方法[6-8]，结合采样点情况，确定抽滤水样体积为250 mL[9]，使用M50型砂芯过滤装置及孔径 0.45 μm的醋酸纤维滤膜进行抽滤。将抽滤后得到的水样分为4组（表1）（每组设置 2个平行样），每组加入 10 mL丙酮溶液（90%），在10 mL塑料离心管中浸提19 h。再将浸提后的提取液使用 LD4-2A离心机以 3 500 r/min的转速离心。最后使用721分光光度计分别依次在750、664、647、630 nm波长处对离心后提取液的上清液测定吸光值，并使用计算方法中“1.3.2.1叶绿素a分光光度法计算”进行叶绿素a含量的计算，计算每组平行水样的平均值。

表1 抽滤后水样的4组浸提条件

4组水样均浸提19 h，浸提过程中振摇1～2次，以减小因溶剂分布不均造成的误差。

1.3.2 计算方法

1.3.2.1 叶绿素a分光光度法计算

将各组提取液经离心后的上清液在664、647、630 nm波长下测得的吸光值，减去其在750 nm波长下测得的吸光值，得到校正后的吸光值 E664、E647、E630，再按公式（1）计算叶绿素a的含量。

式中：ρ（chl-a）为样品中叶绿素a含量，单位：μg/L；V为水样品实际用量，单位：L；L为测定池光程，单位：cm；u为样品提取液体积，单位：mL。

1.3.2.2 标准差

1.3.2.3 变异系数

式中：S为标准差值；X为数据的算术平均值；CV为变异系数。

2 结果与分析

不同浸提条件对叶绿素 a的提取量有显著影响（图2）。冷藏（-1～1 ℃）组提取的叶绿素 a含量显著高于常温（26～30 ℃）组。常温（26～30 ℃）组叶绿素a的浸提易受天气状况影响，所得数据波动较大。因此，叶绿素 a的浸提过程是否具备冷藏条件，很大程度上影响着提取结果的准确性。

4个试验组中，叶绿素a的提取量存在显著差异（P＜0.01）。根据图2与表2，3分析，4个试验组叶绿素 a的提取量从多到少依次为：避光冷藏组＞光照冷藏组＞避光常温组＞光照常温组，说明无论是常温还是冷藏，光照条件下叶绿素 a的降解较快，避光条件下叶绿素a分解相对较慢[5-10]，且在单因素条件下，温度要比光照对叶绿素 a的降解影响更加显著。

图2 不同提取方法测定样本叶绿素a含量结果

表2 A、B点光照与避光条件下温度对叶绿素a提取效果的影响

表3 A、B点冷藏与常温条件下光照对叶绿素a提取效果的影响

3 讨论

3.1 光照和温度对叶绿素a提取量的影响

张武昌等研究了温度和光照对叶绿素 a的降解速率的影响[5]，得出了叶绿素a在不同光照条件及不同温度的黑暗条件下的降解规律。本研究中，避光（低于200 lx）常温（26～30 ℃）组与光照（1 100～1 700 lx）常温（26～30 ℃）组叶绿素a的提取量平均变异系数为27.26%（避光常温组平均提取量高于光照常温组），避光（低于200 lx）冷藏（-1～1 ℃）组与光照（1 100～17 00 lx）冷藏（-1～1 ℃）组叶绿素 a的提取量平均变异系数为11.30%，表明叶绿素a的光降解速率在常温（26～30 ℃）条件下明显快于冷藏（-1～1 ℃）条件。本试验结果与张武昌等[5]的研究结果对应，但由于所研究的温度条件不同，故无法进行数据的比较。

由表2，3可知，避光冷藏组与光照冷藏组叶绿素a提取量的平均变异系数为11.30%（避光冷藏组平均提取量高于光照冷藏组），避光冷藏组与避光常温组叶绿素 a提取量的平均变异系数为27.84%（避光冷藏组平均提取量高于避光常温组），说明在浸提过程中，光照条件对提取效果的影响小于温度，本项对比补充了张武昌等[5]关于温度和光照对叶绿素 a降解速率影响研究中未涉及的方面。

3.2 其他测定条件对叶绿素a降解速率的影响

叶绿素 a的降解可分为暗降解和光降解，根据张武昌等[5]研究表明，光照和温度影响叶绿素a的降解，在-20 ℃条件下，叶绿素 a在黑暗中几乎不降解，在15 ℃条件下，叶绿素a光降解的速度非常快，而暗降解的速度则较慢。

本试验每次离心时间为10 min，叶绿素a在离心过程中降解率为0.02%；抽滤时间为90 min，叶绿素a在抽滤过程中降解率为0.18%。因此，在室温且避光的条件下，离心和抽滤过程中叶绿素a的降解量非常低。

参照 GB17378.7—2007中的方法，结合实际操作过程，注意水样在加入碳酸镁（10 g/L）溶液后，要置于黑暗环境中保存，如需转移，其转移过程也要求严格避光。抽滤过程中，由于抽滤液的体积和浓度不同，造成抽滤时间的不一致，以及抽滤过程中环境光照强度的变化会影响测定结果，所以抽滤过程也应严格避光。水样移入比色皿后，应尽快完成测定，以减少叶绿素 a的光降解。根据周静等[11]研究表明，叶绿素a浸提过程如果采用塑料材质（丙酮对塑料具有腐蚀作用）的离心管作为容器或者冷藏时间过长，测定浮游植物叶绿素a 的提取量都会偏大。

4 结论

对比各试验组叶绿素 a的提取结果、水样的保存、抽滤及浸提过程，冷藏（-1～1 ℃）和避光（光照低于 200 lx）条件下浮游植物叶绿素 a的提取量最大（平均提取量155.73 μg/L）。若浸提不能满足避光（光照低于200 lx）条件，也必须满足冷藏（-1～1 ℃）要求，这样才能获得相对精准有效的叶绿素a浸提数据。

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责任编辑：张爱婷

Effective of Temperature and Illumination on Extraction of Chlorophyll a in Phytoplankton

CAO Xin-sheng1, WU Jun-jun2, SUN Cheng-bo1,CorrespondingAuthor
（1. National Experimental Teaching Demonstration Center of Aquatic Ecology and Breeding Key Laboratory, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Shanghai Sisailu Aquatic Science & Technology Development Co. Ltd,Shanghai 200433, China）

The spectrophotometric method in different conditions of light and temperature, extraction of phytoplankton chlorophyll a determined, to study the different illumination and temperature on the extraction of phytoplankton chlorophyll a and determine phytoplankton chlorophyll a in the optimum conditions of extraction. Strictly avoid light in the filtration process,and use the ice water mixture is cooled to 0 ℃ preservation, water filtration. Leaching provided to avoid light（less than 200 lx refrigerated（-1-1 ℃）group, light（1 100-1 700 lx）cold（-1-1 ℃）group, evades the light（less than 200 lx）at room temperature（26-30 ℃）group and light（1 100-1 700 lx）at room temperature（26-30 ℃）group, each group into the 90% acetone solution extraction 19 h. The average extraction amounts of the four groups were as follows: 155.73 μg/L of the cold storage group and 136.24 μg/L in the light cold storage group, 116.67 μg/L in the ambient temperature group and 89.85 μg/L in the normal temperature group. The results showed that the optimal extraction conditions of phytoplankton chlorophyll a were cold storage and light avoidance.

chlorophyll a; extraction; temperature; illumination

X832

：A

2016-03-08

国家星火计划项目“水产品健康养殖、加工与质量安全控制产业化示范——南美白对虾健康养殖技术示范与推广”（S2011A100020）

曹鑫盛（1993-），男，广西桂林人，本科在读，主要从事水产科学方面的研究。E-mail：wamlybh@163.com。

孙成渤（1957-），男，山东长岛人，教授，学士，主要从事水生生物学和养殖水域生态系统修复技术的研究。E-mail：sunchengbo2003@sohu.com。

1008-5394（2017）02-0049-04