春石斛杂交种与药用金钗石斛3种活性成分的比较研究

章金辉，王再花，旦真次仁，李 杰，朱根发

（1. 广东省农科院环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室，广东 广州 510640；2. 林芝地区科技开发交流服务中心，西藏 林芝 860000）

春石斛杂交种与药用金钗石斛3种活性成分的比较研究

章金辉1，王再花1，旦真次仁2，李 杰1，朱根发1

（1. 广东省农科院环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室，广东 广州 510640；2. 林芝地区科技开发交流服务中心，西藏 林芝 860000）

比较分析了春石斛杂交种Dendrobium Second Love‘Tokimeki’与传统药用石斛金钗石斛活性成分，结果显示，D. Second Love‘Tokimeki’9月至翌年1月的茎多糖含量均值高于金钗石斛；多糖DHPP-Ⅰ数均分子量和重均分子量均低于金钗石斛多糖DNPP-Ⅰ；两种石斛茎都含有所检测的19种氨基酸，金钗石斛所测的氨基酸总量高于D. Second Love‘Tokimeki’，但D. Second Love‘Tokimeki’的8种必需氨基酸总量高于金钗石斛；金钗石斛的Fe和B元素含量显著高于D. Second Love‘Tokimeki’，而D. Second Love‘Tokimeki’的Mn、Zn、Cu元素含量显著高于金钗石斛。通过两种石斛3种活性成分比较可知，D. Second Love‘Tokimeki’ 多糖含量较高，但多糖DHPP-Ⅰ数均分子量和重均分子量均低于金钗石斛多糖DNPP-Ⅰ；D. Second Love‘Tokimeki’的氨基酸、矿质元素与金钗石斛组成相同，但含量有所差异。

石斛；多糖；氨基酸；矿质元素

石斛为兰科石斛属多年生草本植物，是一类重要的观赏兼药用植物，全世界约有1 500余种，主要分布于亚洲热带和亚热带地区至大洋州，我国共分布有74个种、2个变种。石斛的茎是名贵的中药材，具有滋阴清热、益胃生津、清肺明目和提高机体免疫力的功效。《本草纲目》中，李时珍认为石斛能“治发热自汗，痈疽排脓内塞”。清代《药性论》评称石斛有补肾积精、益气力、养胃阴等功效。

金钗石斛又名扁黄草等，盛产于云南、贵州等地，多糖和生物碱是金钗石斛的主要活性成分，同时氨基酸和微量元素也较丰富。春石斛杂交种的始祖源于中国的金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）等名贵药用石斛，经过多年的遗传改良和选育，目前已达上万个品种。当前关于金钗石斛的活性成分、多糖结构、药理活性等方面的报道较多，而关于春石斛杂交种的报道较少，主要集中在组培增殖、试管开花［1］、花期调控［2］及不同器官多糖、生物碱含量研究［3］等方面，关于春石斛杂交种D. Second Love‘Tokimeki’的氨基酸、微量元素及分子量的研究还未见报道。现代研究证明，石斛具有降血糖［4］、抗氧化［5］、抗肿瘤［6-7］、祛痰镇咳及增强免疫力［8-10］等作用，具有较高的药用价值。春石斛杂交种一直作为观赏性花卉进入市场，由于其始祖源于金钗石斛，因此，为了进一步开拓春石斛杂交种在药用方面的潜在价值，本研究以比较春石斛杂交种与金钗石斛3种活性成分的异同为切入点，通过在活性成分上的比较为春石斛杂交种在药用开发利用方面提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）和春石斛杂交种（Dendrobium Second Love ‘Tokimeki’），栽培于广东省农科院环境园艺研究所温室大棚内，为独立盆栽，基质配方、光、温、水肥管理一致。

1.2 试验方法

1.2.1 多糖含量测定 （1）标准曲线制作。设置10个浓度梯度，分别吸取0.05 mg/mL的葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0 mL，各加蒸馏水补至2.0 mL，然后各加6%重蒸苯酚1.0 mL，摇匀，再加入98%浓硫酸5.0 mL，摇匀，静置5 min，再置于沸水浴中加热20 min，冷却至室温，于490 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，得到回归方程为：y=0.0586x+0.0338 （R2=0.997）。

（2）多糖提取。取2.5 年生、9月至翌年1月两种石斛的成熟茎，切成小段，105℃杀青15 min，以60℃烘干至恒重，再制成粉末，过0.25 mm筛。分别称取两种石斛干燥粉末各50 g置于1 000 mL圆底烧瓶中，然后加入石油醚（沸点60～90℃）500 mL，80℃回流提取1 h，抽滤、挥干、溶媒，再加石油醚，相同条件下重复1次；所得两种石斛滤渣分别加入80%乙醇水溶液500 mL，再加入80%乙醇水溶液，相同条件下重复1次，得到两种石斛脱脂干粉；两种石斛脱脂干粉再分别加入蒸馏水500 mL，80℃浸提1 h，抽滤，收集滤液，重复索氏提取提1次；合并两次滤液，减压浓缩，加入预冷无水乙醇使溶液含醇量至80%，4℃静置过夜，离心，收集沉淀，冷冻干燥得到两种石斛粗多糖。将两种石斛粗多糖配制成40 mg/mL的水溶液，以胰酶液和粗多糖溶液的体积比为0.4∶1，加入1 mg/mL的胰蛋白酶，37℃恒温5 h后升温灭酶，然后添加1/3体积的Sevag溶液，剧烈摇荡5 min，离心，弃下层有机相。上层水相继续加入1/3体积的Sevag溶液，按相同条件重复2次，合并上层水相，采用截留分子量为7 500 Da透析袋蒸馏水透析3 d；然后，加入预冷无水乙醇使溶液含醇量至80%，4℃静置过夜，离心，收集沉淀，无水乙醇、丙酮各洗2遍，冷冻干燥后得到两种石斛精多糖，分别命名为金钗石斛DNPP和春石斛杂交种DHPP。

（3）多糖与葡萄糖换算因子的测定。称取金钗石斛精多糖10 mg溶于10 mL蒸馏水，配制浓度为50 μg/mL的多糖溶液，吸取样品溶液0.1 mL，按照标准曲线制作的方法测定吸光度，计算样品中葡萄糖的浓度，由下列公式计算换算因子f：

式中，Cs为石斛精多糖溶液的实际浓度，C为回归方程计算石斛精多糖溶液中葡萄糖的浓度，f为校正系数。依公式计算可得金钗石斛多糖与葡萄糖换算因子f = 2.41，春石斛杂交种多糖换算因子参照金钗石斛。

（4）样品溶液的测定。分别称取3份金钗石斛和春石斛杂交种9月至翌年1月的石斛茎的干燥粉末各1 g，分别加入80%乙醇100 mL，80℃回流提取1 h，抽滤、挥干、溶媒，重复上述操作1次，所得滤渣加入纯水100 mL，80℃回流提取1 h后抽滤，重复上述操作1次，合并滤液，蒸馏水定容至250 mL，摇匀，得到样品溶液。采用改良的苯酚-硫酸比色法测定样品溶液的石斛多糖含量X，计算公式为：

式中，f为石斛多糖与葡萄糖的换算因子，C为各石斛样品溶液中葡萄糖含量，D为样品稀释倍数，W为石斛干粉重量。

1.2.2 多糖分子量测定 取2.5年生、9月至翌年1月两种石斛的成熟茎，用蒸馏水洗净，切成小段，以60℃烘干至恒重，再制成粉末，过0.25 mm筛，用于氨基酸、微量元素测定。

精多糖分级。预处理：取DEAE-52 100 g加入蒸馏水500 mL，浸泡24 h，使纤维素颗粒充分膨胀；去除悬浮的细颗粒后，再加4倍量的0.5 mo1/L HC1浸泡、搅拌4 h；滤去酸液，蒸馏水洗至中性，再加4倍量的0.5 mo1/L NaOH浸泡、搅拌4 h；滤去碱液，蒸馏水洗至中性。如此酸碱反复轮洗，直至洗出液无色澄清为止。最后再用0.5 mo1/L HCL洗涤，即制成Cl-型柱，脱气，备用。将层析柱2.6 cm×50 cm垂直放置，倒入适量pH 8.0的0.05 mo1/L Tris-HCl缓冲液，将DEAE-52悬浊液缓慢倾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4～1/3时打开柱下端出口，让溶液慢慢流出，保持吸附剂表面浸没在溶液中，严防气泡产生，以缓冲液平衡24 h。取多糖样品100 mg溶于5 mL Tirs-HCl缓冲液（pH 8.0），4 000 r/min离心5 min，上清液用于上样。先用适量蒸馏水洗脱后，再用0.3 mo1/L NaCl进行阶段洗脱，洗脱速度控制在1 mL/min，部分收集器的转速为8 mL/管，间隔每管取适量多糖溶液加蒸馏水补足2 mL，苯酚-硫酸法测定490 nm处吸光度。以洗脱液的管数为横坐标，490 nm处吸光度为纵坐标作图，得到洗脱曲线，合并主峰，冻干得到金钗石斛和春石斛杂交种D. Second Love‘Tokimeki’水溶性多糖，分别记为DNPP-I和DHPP-I；用0.3 mo1/L NaCl洗脱所得多糖分别记为DNPP-II和DHPP-II。

GPC条件：色谱柱：TSK SWXL 4000-3000（2柱串联），300 mm（柱长）×7.8 mm（内径），柱温35℃；流动相：0.05 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液（pH 6.7，加0.05% NaN3）；体积流量：0.5 mL/min；示差折光检测器，恒温35℃；进样量20 μL。GPC校正曲线：取已知相对分子质量分别为738、5 800、1.22×104、2.37 ×104、4.8×104、1.0×105、1.86×105、3.8×105的多糖标样，用0.05 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液（pH 6.7，加0.05% NaN3）溶解，经0.45 μm滤膜滤过，进行GPC分析。取10 mg/mLDNPP-I和DHPP-I的样品溶液，按照标准曲线中的条件操作，根据样品的出峰时间在校正曲线上求得多糖峰的平均相对分子质量及其分布。

1.2.3 氨基酸含量测定 标准溶液及样品制备：准确称取10 mg 氨基酸标准品，蒸馏水定容至50 mL，得到200 mg/L的游离氨基酸标准储备液，临用时用空白溶剂稀释得到1.0、5.0、10.0 mg/L系列标准溶液。准确称取0.25 g样品3份，分别置于250 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L盐酸后超声处理30 min，过滤，再取2 mL水解处理，取水解前后的溶液各100 μL于液相色谱样品小瓶中，60℃加热并氮气吹干，取出后，加入3.5 mol/L盐酸正丁醇100 μL，密封样品瓶，60℃衍生化反应30 min。然后60℃加热，氮气吹干，残渣加80%乙腈1 mL，振荡1 min，溶解，0.45 μm 针筒式滤器过滤，于LC-MS/MS测定。

色谱及质谱条件：色谱柱为BDS HYPERSIL C18（2.1 mm×150 mm，2.4 μm） ，流动相为乙腈-水（0.2%甲酸，10 mmol/L甲酸铵）梯度洗脱，梯度洗脱程序：乙腈比例变化为0 min，0%；5min，40%；7 min，80%；8～12 min，0%。流速为0.2 mL/min，进样量1 μL。离子源：电喷雾（ESI），正离子电离模式，干燥气（N2）流量为9.0 L/min，温度为350℃，雾化气（N2）压力为275.8 kPa，电喷雾电压为4 000 V，扫描方式为多反应监测（MRM）模式。

1.2.4 矿质元素含量测定 准确称取0.50 g样品3份，分置于50 mL三角瓶中，然后加入10 mL混合酸（9 mL硝酸+1 mL高氯酸）。密封浸泡过夜后，于电热板上消煮（不超180℃），直至冒白烟，消化液呈无色透明为止，再于25 mL容量瓶中超纯水定容，混匀，得测试液。采用石墨炉原子吸收分光光度计测定矿质元素含量。

试验数据采用Excel和SPSS 13.0 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 多糖含量比较

从图1可以看出，不同月份的石斛茎的多糖含量是不同的，其中金钗石斛茎的多糖含量呈现10月（16.8%）＞11月（14.2%）≈9月（13.7%） ＞12月（10.0%） ＞翌年1月（4.1%）的趋势；春石斛杂交种D. Second Love‘Tokimeki’则表现为12月（23.7%）＞9月（20.8%）＞11月（17.8%）≈10月（16.4%）＞翌年1月（9.5%）。金钗石斛茎多糖含量除10月份与D. Second Love ‘Tokimeki’无显著差异外，其他月份多糖含量均显著低于D. Second Love ‘Tokimeki’。

图1 不同月份金钗石斛和春石斛杂交种茎多糖含量比较

2.2 多糖分子量比较

从图2可以看出，用蒸馏水洗脱时，两种石斛都会有大量的多糖被洗脱下来，而0.3 mol/L NaCl洗脱时两种石斛只有一个较小的多糖洗脱峰；两种石斛的水洗多糖DNPP-Ⅰ和DHPP-Ⅰ占绝大部分，而0.3 mol/L NaCl洗脱多糖DNPP-Ⅱ和DHPP-Ⅱ只有很少一部分。

多糖分子量的大小与其活性存在较大关系。从表1可以看出，数均分子量、重均分子量均是DHPP大于DNPP，而DHPP-Ⅰ的数均分子量和重均分子量均低于DNPP-Ⅰ，在分布宽度方面则呈现DHPP-Ⅰ＞DNPP＞DNPP-Ⅰ＞DHPP。

2.3 氨基酸含量比较

从表2可以看出，两种石斛均含有所检测的19种氨基酸，且两种石斛均含有人体所必需的8种氨基酸，其中以苯丙氨酸含量最高。从必需氨基酸总量来看，金钗石斛、D. SecondLove‘Tokimeki’茎的含量分别为0.423%和0.454%，而游离氨基酸总量为金钗石斛高于D. Second Love‘Tokimeki’。

图2 两种石斛茎多糖DEAE-Cellulose-52 离子交换层析

表1 两种石斛的多糖分子量及其分布

表2 两种石斛茎中19种游离氨基酸含量比较

2.3 矿质元素含量比较

从表3可以看出，在所测的矿质元素中，两种石斛均以Ca元素的含量最高，且D. Second Love‘Tokimeki’高于金钗石斛；其次是Mg和 K，金钗石斛的Mg和K元素含量高于D. Second Love‘Tokimeki’；微量元素表现为金钗石斛、D. Second Love‘Tokimeki’的Mn、Fe元素含量均较高。由于微量元素在维持生命活动中起着重要作用，因此通过微量元素含量的差异可推断石斛的功效各有侧重点。

表3 两种石斛茎中8种矿质元素含量比较

3 结论与讨论

多糖是石斛的主要药效成分之一，李满飞等［11］通过测定25种石斛36个样品的多糖含量，发现石斛生理活性强弱与其多糖的含量有关。本试验结果表明，不同月份之间，两种石斛茎多糖含量高低没有呈现一致的规律性，其中金钗石斛茎多糖含量最高为10月份，远远高于多数文献所报道的水平［12］，这可能是试验材料的差异和取材时间不同所致；D. Second Love‘Tokimeki’茎多糖含量以12月份最高，且显著高于金钗石斛。若以多糖含量为评价标准，金钗石斛以10月为最佳采收季节，D. Second Love‘Tokimeki’以12月为最佳采收季节。

关于石斛多糖的分离、纯化、分级已有一些报道，与本研究结果类似，王军辉［13］将金钗石斛水提粗多糖用DEAE-纤维素分级分离，蒸馏水、NaCl梯度洗脱，Sephadex G-100、Sephacryl S-200进一步纯化，分别得到2个水洗脱组分和5个盐洗脱组分，其中蒸馏水洗脱组分的量最多。在众多药用石斛多糖的提取研究中，水溶性多糖均为主要组分，如霍山石斛［14］、细茎石斛［15］等。多糖分子量的大小与其活性存在较大关系，郝杰等［16］发现相对分子量最大的霍山石斛多糖S（平均分子量为14.79×105Da）对H2O2、·OH的清除作用强于其他多糖组分；鲍素华等［17］发现铁皮石斛多糖分子质量小于3.53 ×104Da或大于7.44×104Da时抗氧化活性较高。本试验所测两种石斛茎多糖的重均分子量与前人报道的石斛多糖重均分子量的检测范围接近，多数在1×104～105Da之间［18］。可见，多糖分子量大小可能取决于多糖种类、纯度和结构等。

氨基酸是人体的生理活性所需物质，近年来研究表明氨基酸与药效存在着一定的关系［19］。何铁光等［20］测定了铁皮石斛原球茎17种氨基酸，其中7种是人体必需氨基酸，而本试验测定了两种石斛茎的19种游离氨基酸，均含有人体所必需的8种氨基酸。在所测氨基酸中，金钗石斛和D.Second Love‘Tokimeki’均以精氨酸（Arg）含量最高。精氨酸具有重要的生理，营养代谢功能如合成细胞浆蛋白和核蛋白，促进伤口复原，肌肉蛋白合成［21］分泌激素，以及改善性欲等作用。精氨酸也有改善肠道的机械屏障和损伤后的黏膜屏障功能［22-23］及促进小肠黏膜生长、发育、适应及恢复创伤等作用［24-25］，还具有提高机体免疫力［26］等作用。本试验结果表明，金钗石斛茎的Arg、Lys和GABA含量均显著高于D. Second Love‘Tokimeki’，而D.Second Love ‘Tokimeki’中有10种氨基酸含量显著高于金钗石斛；从必需氨基酸总量来看，D. Second Love‘Tokimeki’要高于金钗石斛。

人体虽然对微量元素的需求量低，但其在维持人体正常生理功能和生长发育方面起着非常重要的作用［27］。研究发现，铁、锰、铬、锌、钙、镁、铜等元素在造血、保持人体机体免疫力、神经系统发育、生长、生殖发育方面起着重要作用，也对糖尿病、尿毒症等疾病的发生发展发挥着一定的影响［28-29］。金钗石斛茎的Fe和B含量显著高于D. Second Love‘Tokimeki’，说明金钗石斛可能在预防贫血和维持机体免疫力和抗感染能力方面较强；而D. Second Love‘Tokimeki’的Mn、Zn、Cu含量显著高于金钗石斛，说明D. Second Love‘Tokimeki’可能在促进骨骼发育和繁殖性能方面的功效更强。

综上所述，D. Second Love‘Tokimeki’与传统药用石斛金钗石斛相比，在多糖含量方面要优于金钗石斛，春石斛杂交种DHPP-Ⅰ数均分子量和重均分子量均低于金钗石斛DNPP-Ⅰ。在总氨基酸总量方面虽低于金钗石斛，但有达10种氨基酸显著高于金钗石斛，且从必需氨基酸总量来看，D. Second Love‘Tokimeki’的8种必需氨基酸总量高于金钗石斛。矿质元素方面，春石斛品种D. Second Love‘Tokimeki’的Ca、Mn、Zn和Cu含量较多，具有一定的优势。通过春石斛杂交种D. Second Love‘Tokimeki’与传统药用石斛金钗石斛活性成分比较分析，为春石斛杂交种作为金钗石斛的替代品进行开发提供了理论依据。

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（责任编辑 邹移光）

Comparative study of three kinds of active ingredients between Nobile-type Dendrobium and Dendrobium nobile Lindl.

ZHANG Jin-hui1，WANG Zai-hua1，DANZhen ci-ren2，LI Jie1，ZHU Gen-fa1
（1.Environmental Horticulture Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences /Guangdong Key Lab of Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization，Guangzhou 510640，China；2.Linzhi Science and Technology Development and Communication Service Center，Linzhi 860000，China）

This paper analyzed the active ingredients contents betwenDendrobium Second Love‘Tokimeki’and the traditional medicinalD. nobileto provide reference for the development ofD. Second Love‘Tokimeki’. The content of polysaccharide was determined by phenol sulfuric acid colorimetry，and the molecular weight of polysaccharides was detected by Gel Permeation Chromatography. The content of free amino acid was determined by LC-MS/MS. The mineral element content was determined by Graphite furnace atomic absorption spectrophotometer 240ZAA（GTA120Z）. Results showed that the mean value of polysaccharide content ofD. Second Love‘Tokimeki’was higher than that ofD. nobilefrom September to January of next year，the number-average molecular weight and weight- average molecular weight of DHPP-ⅠofD. Second Love‘Tokimeki’ were lower than DNPP-ⅠofD. Nobile. There were 19 kinds of free amino acids measured in both species ofDendrobiums，the total free amino acid content ofD. nobilewas higher than that ofD. Second Love‘Tokimeki’，but the total content of eight kindsof essential amino acids inD. Second Love‘Tokimeki’ was higher than that ofD. Nobile. The content of Fe and B elements ofD. nobilewere higher than those ofD. Second Love‘Tokimeki’，but the content of Mn，Zn and Cu elements ofD. Second Love‘Tokimeki’ were higher than those ofD. Nobile. By comparative analysis of three kinds of active ingredients in both species ofDendrobiums，we can know that the polysaccharide content ofD. Second Love‘Tokimeki’ was higher，and the number-average molecular weight and weight-average molecular weight of DHPP-Ⅰ ofD. Second Love‘Tokimeki’ were lower than DNPP-ⅠofD. Nobile，the composition of free amino acids and mineral element in both species ofDendrobiums were the same，but the contents were different. The results could provide a reference for the medicinal development ofD. Second Love‘Tokimeki’ .

Dendrobium；polysaccharide；free amino acids；mineral element

S567.23+9

A

1004-874X（2017）04-0024-08

章金辉，王再花，旦真次仁，等. 春石斛杂交种与药用金钗石斛3种活性成分的比较研究［J］.广东农业科学，2017，44（4）：24-31.

2016-11-08

广东省科技计划项目（2015A020210084，2014A020209058）

章金辉（1986-），男，硕士，助理研究员，E-mail：zhangjinhui41@163.com

朱根发（1968-），男，博士，研究员， E-mail：genfazhu@163.com