脂肪酶催化饱和单甘酯与棕榈油酯交换制备含甘油二酯油及其结晶特性研究

刘 尊，仇超颖，宋 佳，杨 雪，张 宁，汪 勇

(1. 暨南大学 食品科学与工程系，广东高校油脂生物炼制工程技术研究中心，广州 510632；2. 暨南大学-萨斯喀切温大学“油料生物炼制与营养”联合实验室，广州 510632)

油脂化学

脂肪酶催化饱和单甘酯与棕榈油酯交换制备含甘油二酯油及其结晶特性研究

刘 尊1，2，仇超颖1，2，宋 佳1，2，杨 雪1，2，张 宁1，2，汪 勇1，2

(1. 暨南大学 食品科学与工程系，广东高校油脂生物炼制工程技术研究中心，广州 510632；2. 暨南大学-萨斯喀切温大学“油料生物炼制与营养”联合实验室，广州 510632)

采用脂肪酶Lipozyme TL IM催化饱和单甘酯和棕榈油(24℃)进行酯交换反应，酯交换油脂经分子蒸馏分离纯化得到含28.10%甘油二酯(DAG)油。对比分析了酯交换反应前后油脂的甘油酯组成和脂肪酸组成、热力学性质以及固体脂肪含量(SFC)。结果表明：含DAG油的不饱和脂肪酸含量提高至42.94%，熔点降低至45.4℃，SFC值显著降低；X射线衍射结果表明含DAG油的晶型以β型和β′型为主；偏光显微镜观察结果表明含DAG油的晶体网络结构主要由球状晶体聚集而成，且晶体尺寸变小，固液相分散更均匀；结晶熔化曲线、SFC分布以及结晶特性均表明含DAG油适合用作食品专用油脂基料。

饱和单甘酯；脂肪酶Lipozyme TL IM；酯交换；含DAG油；固体脂肪含量；晶型

受中西饮食文化交流、贯通的影响，面包、蛋糕等西式产品越来越受到消费者的青睐，人造奶油、起酥油等塑性脂肪以其优良的风味而被广泛应用于烘焙、糕点等食品行业。油脂氢化技术是应用于塑性脂肪加工的有效手段之一，氢化工艺虽然改善了油脂的稳定性和物理性质，但是伴随产生大量的反式脂肪酸[1]。许多研究表明，人体若摄入过多含反式脂肪酸的食物会加速动脉硬化，增加诱发冠心病、心脑血管病、糖尿病和老年痴呆等疾病的风险[2]。2006年美国食品药品监督管理局(FDA)要求产品必须标明反式脂肪酸和饱和脂肪酸的含量[3]，2015年美国FDA要求在3年内禁止人造反式脂肪酸产品应用于食品。膳食中的饱和脂肪酸含量与人体血清中低密度脂蛋白(LDL)呈正相关[4-5]，世界卫生组织建议膳食中饱和脂肪酸提供的能量应低于膳食总能量的10%[6]。

甘油二酯(DAG)是一类甘油三酯(TAG)中一个脂肪酰基团被氢原子取代的结构脂质[7-8]，有1,2-DAG 和1,3-DAG两种异构体。食用油中的DAG具有调节餐后血清TAG和血糖功能，预防动脉血栓形成且能控制脂肪聚集引起的肥胖，这些功能主要是通过抑制TAG在体内蓄积实现。相比脂肪酸组成相同的甘油三酯，1,3-DAG的熔点要高10℃以上[9-10]。这意味着如果油脂体系中含有一定的DAG组分，在达到相同熔点时，体系的饱和脂肪酸含量可以有效地下降。由于天然食用油中DAG的含量不超过10%[11]，因此通过酶法催化手段提高油脂中DAG的含量已成为功能性油脂研究领域的热点。

本研究采用脂肪酶Lipozyme TL IM催化饱和单甘酯和棕榈油(24℃)发生酯交换反应，生成含甘油二酯(DAG)的酯交换油脂，再将酯交换油脂经分子蒸馏分离纯化得到含DAG油，并对其理化特性与结晶特性进行分析，为含DAG油在食品专用油脂领域的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

饱和单甘酯(纯度≥94%)：广州美晨集团股份有限公司；棕榈油(24℃)：广州至润油脂食品工业有限公司；固定化脂肪酶Lipozyme TL IM：诺维信(中国)生物技术有限公司；正己烷、丙酮均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

RE-52AAA旋转蒸发器；MD-80分子蒸馏设备；7820A气相色谱仪：美国安捷伦公司；DSC1型差示扫描量热仪：梅特勒-托利多公司；NM-2型核磁共振分析仪：上海纽迈电子科技有限公司；MSAL-XD-II型X射线衍射仪：北京普析通用仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酶催化酯交换反应

原料饱和单甘酯和棕榈油(24℃)的质量比为2∶8，称取300.0 g原料混合物放入500 mL的圆底烧瓶中，待原料完全熔化后加入5%催化剂固定化脂肪酶Lipozyme TL IM，于旋转蒸发器真空条件下反应，设定反应温度65℃，反应时间3 h，转速 100 r/min。反应结束后静置，待油样和酶完全分层后，取上层油相，得酯交换粗产物。

1.2.2 分子蒸馏纯化酯交换粗产物

酯交换粗产物经过二级分子蒸馏分离纯化除去游离脂肪酸和单甘酯，得到含DAG油。第二级蒸馏柱温度190℃，内冷凝温度60℃，绝对压力0.1 Pa，刮膜电机转速300 r/min。分子蒸馏轻相为游离脂肪酸和单甘酯的混合物，分子蒸馏重相为含DAG的油。

1.2.3 甘油酯组成分析

取酯交换前后油脂各50.0 mg，以丙酮-正己烷(体积比1∶1)定容至5.0 mL，0.45 μm滤膜过滤后待测。气相色谱条件：DB-1ht型毛细管柱(15 m×0.25 mm×0.1 μm)；氢火焰离子化检测器和进样口温度均为380℃；分析采用恒流模式，流速4.17 mL/min，压力108.3 kPa；进样量0.5 μL，分流比40∶1；载气为氮气；升温程序为50℃保持1 min，以50℃/min升至100℃，80℃/min升至220℃，30℃/min升至290℃，再以50℃/min升至330℃保持2 min，最后以50℃/min升至380℃保持3 min。以各物质的峰面积总和为基数，采用面积归一化法计算各组分的相对含量。

1.2.4 脂肪酸组成分析

气相色谱法分析酯交换前后油脂脂肪酸组成。样品甲酯化参照GB/T 17376—2008，采用三氟化硼-甲醇快速甲酯化方法。气相色谱条件[12]：采用DB-wax型毛细管柱(10 m×0.1 mm×0.1 μm)，进样口、检测器温度均为240℃；进样量0.5 μL，分流比40∶1，载气为高纯氮气；柱箱升温程序，初始温度为100℃，以10℃/min升至220℃并保持2 min，再以40℃/min升至240℃保持4 min。

1.2.5 热力学性质分析

采用差示扫描量热仪分析酯交换前后油脂的结晶熔化性质。称取9.0～12.0 mg样品于铝坩埚内并加盖密封，空坩埚作为参比，高纯氮气流速为45 mL/min。程序控温如下：初始温度为25℃，40℃/min升至80℃并保持10 min，消除历史结晶，以5℃/min冷却到-50℃并保持10 min，再以5℃/min 加热到80℃。通过动态的升降温过程，得到结晶曲线和熔化曲线。

1.2.6 固体脂肪含量(SFC)的测定

利用脉冲核磁共振仪测定酯交换前后油脂的固体脂肪含量。称取1.5 g样品于专用玻璃样品管中，80℃条件下样品全部溶解，然后放置60℃水浴加热30 min消除历史结晶记忆。0℃在低温恒温槽保留90 min后，每升高5℃恒温保留30 min，测定每个温度下的SFC值。测定温度范围为0～55℃。

1.2.7 晶型分析

采用X射线衍射仪测定酯交换前后油脂的晶型。分析条件：工作电压36 kV，电流20 mA，Cu靶，温度为室温，扫描角度为5°～30°，扫描速度为2(°)/min。

1.2.8 PLM观察晶体形态

采用偏光显微镜(PLM)观察酯交换前后油脂的晶体微观结构。将适量样品在80℃熔化后，盖上已预热的盖玻片，迅速转移至偏光显微镜视野下观察。用Canon数码相机观察样品在室温下的结晶形态，显微镜放大倍数为400倍。

2 结果与讨论

2.1 原料和酯交换前后油脂的甘油酯和脂肪酸组成分析

对原料以及酯交换前后油脂的甘油酯和脂肪酸组成进行分析，结果见表1。

表1 原料及酯交换前后油脂的甘油酯和脂肪酸组成 %

由表1可知，饱和单甘酯与棕榈油(24℃)的物理混合油的DAG含量仅为4.77%，经酯交换反应后，油脂中DAG含量提高至26.00%，这是因为酶催化单甘酯和甘油三酯生成了DAG。酯交换油脂经分子蒸馏分离得到的轻相主要为游离脂肪酸(18.00%)和单甘酯(66.70%)，分子蒸馏重相(含DAG油)则主要由DAG(28.10%)和TAG(71.20%)组成。分离除去游离脂肪酸和单甘酯后，与酯交换油脂相比，含DAG油的DAG与TAG的比例略有增加。油脂体系中的DAG含量过高，油脂氧化稳定性较差[13]。DAG含量过低，则其对塑性油脂体系的加工特性和营养特性影响有限。

从脂肪酸组成分析来看，分子蒸馏轻相的饱和脂肪酸含量最高，为76.96%，酯交换油脂的饱和脂肪酸含量为60.78%，主要的饱和脂肪酸组分是棕榈酸和硬脂酸。含DAG油的不饱和脂肪酸含量最高(42.94%)，分子蒸馏轻相的分离降低了饱和脂肪酸的含量，其主要的不饱和脂肪酸组分是油酸(35.50%)和亚油酸(7.44%)。

2.2 结晶曲线与熔化曲线

油脂脂肪酸和甘油酯组成的不同都会对其热力学性质造成影响。图1和图2分别是酯交换前后油脂结晶曲线和熔化曲线，对曲线进行积分处理得到各峰对应的峰温(Tp)及焓变(ΔH)，结果如表2所示。

从图1结晶曲线可知，物理混合油在低温区有3个放热峰(Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ)，高温区有1个放热峰(Ⅰ)(图1a)。物理混合油具有较高的初始结晶温度T0(51.0℃，见表2)，是由于其较高的饱和脂肪酸含量(60.71%，见表1)。相比物理混合油，酯交换油脂在高温区结晶峰消失，峰I向低温移动(图1b)，初始结晶温度T0降低至38.1℃(见表2)。这是由于饱和单甘酯与棕榈油发生酯交换反应后，降低了高熔点单甘酯含量。分子蒸馏轻相是游离脂肪酸与单甘酯混合物，高温区放热峰(Ⅰ)主要是饱和单甘酯(图1c)。分子蒸馏轻相的初始结晶温度T0(50.4℃，见表2)与物理混合油相近，但是结晶焓(49.0 J/g，见表2)却远远高于物理混合油(4.69 J/g，见表2)，这是因为分子蒸馏轻相主要成分是高熔点的单甘酯，且含有更高的饱和脂肪酸含量[14](76.96%，见表1)。含DAG油呈现5个放热峰(图1d)，在10～30℃温度范围出现两个宽结晶峰(峰Ⅰ和峰Ⅱ)，这些可能是高熔点甘油二酯和甘油三酯的放热峰。相比酯交换油脂，含DAG油的T0(34.0℃，见表2)和结晶焓(5.23 J/g，见表2)都有所降低，这可能是因为含DAG油中不饱和脂肪酸含量增加的缘故。

注：a.物理混合油;b.酯交换油脂;c.分子蒸馏轻相;d.分子蒸馏重相(含DAG油)。下同。

图1 酯交换前后油脂的DSC结晶曲线

图2 酯交换前后油脂的DSC熔化曲线

项目物理混合油酯交换油脂分子蒸馏轻相分子蒸馏重相(含DAG油)初始结晶温度/℃51.0038.1050.434.00结晶焓/(J/g)4.6920.4049.05.23熔点/℃65.2046.2059.145.40熔融焓/(J/g)-0.42-8.02-19.5-1.65

依据图2的熔化曲线可知，物理混合油和分子蒸馏轻相的熔点较高，分别为65.2℃和59.1℃(见表2)，是因为它们的饱和脂肪酸含量都较高。分子蒸馏轻相出现5个吸热峰，在高温区(40～60℃)有两个较强吸热峰(Ⅳ，Ⅴ)(图2c)，这是因为其主要组分为高熔点的饱和单甘酯。酯交换油脂有4个明显吸热峰，相比物理混合油，中熔融区现1个新的吸热峰(Ⅲ)(图2b)。其吸热峰Ⅳ的熔化温度向低温移动，熔点为46.2℃(见表2)，可能是因为酯交换生成了DAG，并同时降低了饱和单甘酯的含量。含DAG油吸热峰与酯交换油脂类似，但出现了5个吸热峰，中熔融区出现2个新的吸热峰(峰Ⅲ和峰Ⅳ)，且熔化的温度范围变宽(图2d)。吸热峰Ⅴ的熔点降低至45.4℃，熔融焓为-1.65 J/g(见表2)。通过分子蒸馏除去了大部分高熔点的单甘酯，和酯交换油脂相比，含DAG油的高温吸热峰(Ⅴ)峰高较低。

2.3 固体脂肪含量

固体脂肪含量是油脂的一个重要物理指标，它对油脂的外观、口感、涂抹性和包装起决定性影响。本研究采用脉冲核磁共振仪，分析酯交换前后油脂的固体脂肪含量随温度变化的趋势，其SFC-T曲线如图3所示。

图3 酯交换前后油脂的SFC-T曲线

从图3可以看出，酯交换前后油脂的SFC值发生了明显变化。整体上，4组样品的SFC值均符合随温度的升高而下降的趋势。在0℃时，物理混合油的SFC值最高，为78.0%，酯交换油脂和分子蒸馏轻相分别为61.0%和73.6%，分子蒸馏重相(含DAG油)的SFC值最低，为59.0%，酶法酯交换显著降低了全饱和固体甘油酯含量。除去高熔点的单甘酯后，含DAG油的SFC值在整个温度范围都低于酯交换油脂。

一般地，塑性脂肪产品的SFC值需在20℃时大于10%，防止液油溢出；室温下保持在15%～35%，才能具备良好的涂抹性和塑性。在0～25℃温度范围内，含DAG油的SFC值迅速下降：20℃时为22.3%，25℃时保持15.4%的固体脂肪含量。在35～45℃范围SFC值已降低至3.51%，满足人体温度下入口后能快速熔化，吸收大量热产生凉爽口感，而无黏胶感和蜡感[15]，且具有理想的宽温度范围。所以本文研制的含DAG油可以用来制备人造奶油、起酥油等塑性脂肪专用油脂。

2.4 晶型分析

油脂的晶型影响着产品的结构和功能性质。X射线衍射用于研究甘油酯同质多晶现象。短间距d值为两个衍射晶面之间的间隔，晶型不同其d值也不同，通过d值的差异即能反映不同的晶体类型。短间距d=4.15 Å为α晶型，d=3.8 Å和4.2 Å附近强衍射峰为β′晶型，d=4.6 Å附近强衍射峰为β晶型。酯交换前后油脂的XRD分析结果见图4。

图4 酯交换前后油脂的XRD图谱

由图4可知，物理混合油在d=4.15 Å附近出现1个强衍射峰，而在3.8 Å和4.2 Å处吸收峰相对较弱(图4a)，表明物理混合油是混合晶型，且以α型为主要晶型，α晶型最不稳定易转变成β或β′晶型。酯交换油脂的衍射峰发生了变化，4.15 Å处峰强度减弱，4.6 Å处出现了新的强衍射峰(图4b)，表明酯交换甘油酯分子的脂肪酸链发生了位置重排，体系晶型发生转变，形成β型和β′型混合晶型。分子蒸馏轻相则在4.15 Å和4.6 Å位置有较强吸收峰(图4c)，说明以α型和β型混合晶型为主，这是因为单甘酯的晶型主要是α型。含DAG油出现4个衍射峰，但4.6、4.15 Å处的吸收峰强度减弱(图4d)，表明除去单甘酯后整个体系油脂晶仍为β和β′型混合晶型，但4.6 Å处吸收峰的强度相比酯交换油脂有所减弱。这可能是因为体系中一定含量的DAG延缓了甘油三酯β′晶型向β晶型转化[16-17]。β′晶型是由相对较小的晶体颗粒聚集而成，晶体网络结构具有较大的表面积，有能力束缚大量的液油和水相，能为塑性脂肪提供良好的塑性、涂抹性及口感，有效防止产品后期出现起砂现象。β′晶型是人造奶油、起酥油等塑性脂肪产品理想的晶型，所以含DAG油符合塑性脂肪产品专用油脂的晶型特性。

2.5 晶体形态分析

偏光显微镜(PLM)可以更直观地看到油脂样品中单个或多个晶体聚集成的聚合物的晶体形态，晶体的三维网络分布能够更好地反映样品的结晶性质。物理混合油、酯交换油脂、分子蒸馏轻相和分子蒸馏重相(含DAG油)在室温环境、400倍视野下观察到的晶体形态如图5所示。

图5 酯交换前后油脂的在25℃的PLM图像

从图5可以看到，酯交换前后样品的晶体微观形态发生了显著变化。物理混合油在初期生成尺寸较小的球晶，球晶进一步聚集成尺寸较大的晶体聚合物，最终以无序的棒状晶束存在(图5a)。因为棕榈油(24℃)在观察温度(25℃)下是呈液态的，所以物理混合观察到的主要是高熔点单甘酯的结晶形态。相比物理混合油，酯交换油脂的的晶体尺寸变小，可以观察到细小的针状晶体和球状晶体呈均匀混合分布(图5b)。这是由于酯交换反应降低了高熔点单甘酯组分，同时生成了DAG。分子蒸馏轻相则呈现密集的针状晶体(图5c)，该针状晶体主要是饱和单甘酯，但其晶体尺寸比物理混合油中的要小。含DAG油中针状晶体消失，晶体网络结构变成球状晶体为主，晶体平均尺寸显著变小。脂肪晶体不再紧密聚集，而是呈均匀分散，液油被包裹在晶体网络结构中(图5d)。这是因为含DAG油分离除去了单甘酯，球状晶体则主要是DAG的结晶形态，这与张宁等[18]报道PLM观察到的DAG的晶体微观形态是相似的。含DAG油的晶型主要是颗粒较小的β′型晶体，这与X衍射的分析结果一致。

3 结 论

利用脂肪酶Lipozyme TL IM催化饱和单甘酯和棕榈油(24℃)酯交换，再将酯交换油脂经分子蒸馏分离得到DAG含量为28.10%的含DAG油。通过分析酯交换前后油脂的性质，结果表明除去高熔点的单甘酯后，含DAG油中不饱和脂肪酸含量为42.94%，其熔点和SFC性质也得到显著改善，使油脂的塑性范围变宽。X射线衍射结果显示，含DAG油的晶型是以β晶型和β′晶型为主。偏光显微镜观察到含DAG油的晶体微观形态为细小、均匀的球型晶体，固液相分布均匀，形成良好的网络晶体结构。以上结果表明，酶催化酯交换制备得到的含DAG油在食品专用油脂领域应用具有良好的发展潜力。

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Preparation and crystallization behaviors of diacylglycerol-contained oil by interesterification of saturated monoacylglycerols and palm olein catalyzed by lipase

LIU Zun1,2, QIU Chaoying1,2, SONG Jia1,2, YANG Xue1,2,ZHANG Ning1,2, WANG Yong1,2

(1. Guangdong Engineering Technology Research Center for Oils and Fats Biorefinery,Department of Food Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China;2. Guangdong Saskatchewan Oilseed Joint Laboratory, Guangzhou 510632, China)

Interesterification of saturated monoacylgcerols and palm olein (24℃) was catalyzed by Lipozyme TL IM, then the oil containing 28.10% DAG was separated by molecular distillation. The glyceride composition, fatty acid composition, thermodynamic property and solid fat content (SFC) of the oil before and after interesterification were detected. The results showed that the contents of unsaturated fatty acid of the DAG-contained oil increased to 42.94%; the melting decreased to 45.4℃ andSFCdecreased remarkably. XRD results indicated that the main crystal forms of the DAG-contained oil mixtures wereβandβ′. PLM results indicated that crystal network of DAG-contianed oil was mainly composed of spherical crystals with smaller size, and the distribution of solid and liquid phase was more evenly. The crystallization and melting curve,SFCdistribution and crystallization behavior indicated that the DAG-contained oil could be applied as a special base oil in food industry.

saturated monoacylgcerols; Lipozyme TL IM; interesterification; DAG-contained oil; solid fat content; crystal form

2016-08-02；

2016-08-22

国家自然科学基金项目(31371785)；广东省科技计划项目(2013B090800009)；教育部“新世纪优秀人才”支持计划(NCET-12-0675)；广州市科技计划项目(2014Y2-00192)

刘 尊(1991)，女，硕士研究生，研究方向为功能油脂(E-mail)346803107@qq.com。

张 宁，副教授，博士(E-mail) tzhning@jnu.edu.cn;汪 勇，研究员，博士(E-mail) twyong@jnu.edu.cn。

TS225.6； TS201.7

A

1003-7969(2017)06-0044-06