玉米黑粉菌的生物学特性研究

翟 璐，于 琦，侯朵朵，刘馨晨，步洪石，孟佳启，王淑敏

（长春中医药大学，吉林 长春 130117）

玉米黑粉菌的生物学特性研究

翟 璐，于 琦，侯朵朵，刘馨晨，步洪石，孟佳启，王淑敏*

（长春中医药大学，吉林 长春 130117）

探究不同碳源、氮源、微量元素、pH、温度等对玉米黑粉菌菌丝生长的影响，选出适合玉米黑粉菌生长的条件。通过单因素试验对菌丝形态、生长势、生长速度进行分析比较，选出适合玉米黑粉菌生长的最佳碳源、氮源、微量元素、pH和温度。通过正交试验优化碳源、氮源、微量元素的比例。结果表明，最佳生长条件为葡萄糖1%、酵母粉1%、MgSO40．1%、KH2PO40．15%，pH6～7，温度20℃～30℃。培养周期为4 d～7 d。通过对玉米黑粉菌的生物学特性研究，掌握其菌丝体生长、繁殖所适宜的营养条件及环境条件，为玉米黑粉菌的开发利用提供参考。

玉米黑粉菌；培养基；生长速度

玉米黑粉菌 [Ustilago maydis（DC．）Corda]属于担子菌纲 （Basidiomycetes） 黑粉菌目 （Ustilaginales）黑粉菌科（Ustilaginaceae） 黑粉菌属（Ustilago）。玉米黑粉菌又叫玉米乌米，乌米是很多东北老辈儿小时候的一种回忆，而现在，很多年轻人也从长辈那听到了乌米的营养价值，“乌米”还有很多响亮的名字，比如说墨西哥松露、玉米蘑菇、乌米等，不仅可以吃，还可以入药。玉米黑粉菌幼嫩时可以食用，含有丰富的蛋白质、膳食纤维、矿物质（尤其是K、Fe、Se含量较高）、维生素、真菌多糖以及合理的必需氨基酸组成，玉米黑粉菌是开发保健食品的优质天然原料。

玉米黑粉菌可以加工药用，性寒，味甘，具利肝脏、益脾胃和解毒通便作用，用于血虚，津液不足，口干舌燥，热血气阴两伤，神经衰弱，小儿疳积和肝病胃病。据文献报道，其菌液对小白鼠肉瘤S180具有抑制作用。

玉米黑粉菌孢子近球形至球形，有时椭圆形或卵圆形，有微小刺，淡褐色，大小（8～12） μm×（7.5～11）μm。图1和图2分别为玉米黑粉菌孢子堆和孢子电镜扫描图片。本实验供试菌株从玉米黑粉菌孢子堆中取孢子，经分离纯化为纯种玉米黑粉菌菌种，并进行生物学特性研究。

图1 玉米黑粉菌孢子堆（图片来自网络）Fig.1 Sporus of Ustilago maydis(picture from the network)

图2 玉米黑粉菌孢子（×5000）Fig.2 Spore of Ustilago maydis(×5000)

2 材料与方法

2.1 实验材料与试剂

2.1.1 供试菌株

供试菌株由长春中医药大学生物制药实验室提供。葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖、酵母粉、蛋白胨、(NH4)2SO4、NH4NO3、MgSO4、CaCO3、KH2PO4、尿素、VB1、玉米粉、麦麸、豆饼粉，均来自于北京化工厂。

2.1.2 供试培养基组成

（1）碳源培养基

基础培养基：马铃薯汁20%、蛋白胨2%、KH2PO40.15%、MgSO40.10%、琼脂2%，pH自然。

（2）氮源培养基

基础培养基：马铃薯汁20%、葡萄糖3%、KH2PO40.15%、MgSO40.10%、琼脂2%，pH自然。

（3）微量元素培养基

基础培养基：马铃薯汁20%、葡萄糖3%、蛋白胨2%、琼脂2%，pH自然。

（4）正交优化培养基

正交优化培养基因素分别为葡萄糖、酵母粉、MgSO4、KH2PO4，按照表4的L9（34）不同比例配制培养基。

（5）pH试验

马铃薯汁20%、葡萄糖1%、酵母粉1%、琼脂2.2%、MgSO40.1%、KH2PO40.15%。

（6）温度试验

马铃薯汁20%、葡萄糖1%、酵母粉1%、琼脂2.2%、MgSO40.1%、KH2PO40.15%。

2.2 实验方法

菌种经过筛选、分离、纯化为纯种玉米黑粉菌菌种。考察组每组平行3只试管，按照实验方法配制培养基，后经过高压灭菌并在无菌操作下分别接种0.5 cm×0.5 cm大小的菌块，于培养箱25℃避光培养。自萌发日开始每日记录菌丝状态，测量菌落面积，比较生长速度。

2.2.1 碳源

试验设置6组平行，其中1组作为对照，其他组分别加入葡萄糖3%、蔗糖3%、木糖3%、乳糖3%、玉米面浸出液6%。

2.2.2 氮源

试验设置8组平行，其中1组为对照，其他组分别加入酵母粉2%、麦麸浸汁5%、蛋白胨2%、尿素 0.2%、豆饼粉浸汁 4%、 (NH4)2SO40.2%、NH4NO30.2%。

2.2.3 微量元素

试验设置7组平行，其中1组为对照，其他组分别加入MgSO40.10%、KH2PO40.15%、CaO 0.1%、NaH2SO40.15%、VB10.05%、MgSO40.10%、KH2PO40.15%。

2.2.4 正交优化试验

根据单因素实验筛选结果，按L9（34）设计四因素三水平配制9组不同培养基，配方见表1。

2.2.5 pH

根据优化的培养基结果，采用0.1 mol·L-1HCL和20%NaOH调节培养基pH分别为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5。

2.2.6 温度

表1 L9（34）正交试验培养基优化因素和水平Tab.1 Orthogonal experimental of L9(34)on medium optimization factors and levels

采用优化的培养基配制5组相同的培养基，分别放在设置温度为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的培养箱中培养。

3 结果分析

3.1 碳源

不同碳源对玉米黑粉菌菌丝生长的影响见表2、图3。

图3 不同碳源条件下玉米黑粉菌生长速度Fig.3 Growth rate of Ustilago maydis with different carbon sources

从表2和图3可以看出，碳源为葡萄糖的菌丝长势旺盛，菌丝洁白、厚、致密、均匀，菌落边缘整齐，气生菌丝合适，无杂菌污染且生长速度最快。玉米黑粉菌菌丝生长的碳源宜选择葡萄糖。

表2 不同碳源对菌丝生长的影响Tab.2 Effects of different carbon sources on mycelia growth

3.2 氮源

不同氮源对玉米黑粉菌菌丝生长的影响见表3、图4。

表3 不同氮源对菌丝生长的影响Tab.3 Effects of different nitrogen sources on mycelia growth

根据表3和图4结果，氮源为酵母粉时菌丝洁白、致密、厚、均匀，长势旺盛，菌落边缘较整齐，气生菌丝合适，无杂菌污染且生长速度最快。玉米黑粉菌生长的最佳氮源宜选择酵母粉。

3.3 微量元素

不同微量元素对玉米黑粉菌菌丝生长的影响情况见表4、图5。

根据表4、图5的分析，当微量元素是MgSO4和KH2PO4时，菌丝状态最佳，长势旺盛，菌落边缘整齐，气生菌丝较合适，无杂菌污染，生长速度最快。玉米黑粉菌的微量元素选择MgSO4和KH2PO4。

表4 不同微量元素对菌丝生长的影响Tab.4 Effects of different trace elements on mycelia growth

图4 不同氮源条件下玉米黑粉菌生长速度Fig.4 Growth rate of Ustilago maydis with different nitrogen sources

3.4 培养基优化试验

根据单因素试验筛选结果，按L9（34）正交设计，结果见表5，方差分析结果见表6。

图5 不同微量元素对玉米黑粉菌菌丝生长的影响Fig.5 Effects of different trace elements on mycelia growth of Ustilago maydis

表5 L9(34)正交试验表及结果Tab.5 L9(34)orthogonal experimental table and results

根据表6方差分析表，可知KH2PO4使结果具有显著性差异（P＞0．05），通过表5中极差大小分析可知，4种影响因素对结果的影响顺序为KH2PO4＞葡萄糖＞MgSO4＞酵母粉。正交优化结果为葡萄糖1%、酵母粉1%、MgSO40．1%、KH2PO40．15%。

表6 斜面培养基优化方差分析表Tab．6 Optimization of variance of slant medium

3.5 不同pH对菌丝生长的影响

不同pH对菌丝生长的影响结果见表7、图6。

表7 不同pH对菌丝生长的影响Tab．7 Effects of different pH values on mycelia growth

图6 不同pH条件下玉米黑粉菌生长速度Fig．6 Growth rate of Ustilago maydis with different pH values

图7 不同温度条件下玉米黑粉菌生长速度Fig．7 Growth rate of Ustilago maydis with different temperatures

根据表7、图6，玉米黑粉菌在pH为6～7的范围内均能以较快速度生长。生长速度显示其生长能力强，中性以及中性偏酸的条件，更适合它的生长。

3.6 不同温度对菌丝生长的影响

不同温度对菌丝生长的影响结果见图7、表8。

从图7、表8可以看出，玉米黑粉菌在20℃～30℃的范围内均能生长。温度低于20℃或者高于30℃均可以抑制它的生长，这在实际生活中具有重要意义。

4 结论与讨论

4.1 结果

从试验结果可知，玉米黑粉菌的最适碳源是葡萄糖，最佳氮源是酵母粉，最适宜生长的微量元素选择KH2PO4和MgSO4。正交优化试验优化培养基为葡萄糖1%、酵母粉1%、MgSO40．1%、KH2PO40．15%。玉米黑粉菌在pH为6～7和温度20℃～30℃的条件下均能以较快速度生长。

表8 不同温度对菌丝生长的影响Tab．8 Effects of different temperature on mycelia growth

4.2 讨论

培养条件中葡萄糖、酵母粉、KH2PO4和MgSO4均经济易得，适合玉米黑粉菌的生长，玉米黑粉菌对环境条件适应性强。酵母粉除提供氮源外，还提供大量的无机盐及生长因子，但有机氮源来源不稳定，成份复杂，所以利用有机氮源时要考虑到原料波动对发酵的影响。试验筛选出适合于菌丝体培养和菌种保藏的条件，为玉米黑粉菌菌丝体液体培养及成分提取、分离奠定基础。

[1]石太渊，王霁，孙大为，等．玉米黑粉菌多糖提取工艺研究[J]．食品科技，2007（2）：142-144，150．

[2]石太渊，孙大为，张锐，等．玉米黑粉菌的加工利用分析[J]．农产品加工：学刊，2006（9）：28-30，32．

[3]王永斌，王允祥．玉米黑粉菌培养条件响应面法优化研究[J]．中国酿造，2006（5）：56-60．

[4]王辉，斯琴格日乐，马端辉，等．玉米黑粉菌孢子粉的无机元素和氨基酸含量测定[J]．菌物研究，2006（1）：20-23．

[5]石太渊，姜福林，张华，等．玉米乌米营养成分分析[J]．食品科技，2006（1）：136-138．

[6]费尚芬，李红梅，王守理，等．玉米黑粉菌多糖发酵的初步研究[J]．食品科学，2002（11）：83-85．

著作权转让声明

全体著作权人：

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注：不同意上述转让声明的著作权人，在收到论文刊用通知5日内书面回复《中国食用菌》编辑部。

Study on the Biological Characteristics of Ustilago maydis

ZHAI Lu,YU Qi,HOU Duo-duo,LIU Xin-chen,BU Hong-shi,MENG Jia-qi,WANG Shu-min
(Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

Effects of different carbon sources,nitrogen sources,trace elements,pH value and temperature on mycelial growth of Ustilago maydis were studied,and the conditions suitable for the growth of U.maydis were selected．The optimal carbon source, nitrogen source,trace element,pH and temperature were selected for the growth of strain by single factor investigation．The proportion of the carbon source,nitrogen source,trace elements were optimized by orthogonal experiment．The optimum growth conditions were glucose of 1%,yeast powder of 1%,MgSO4of 0．1%,KH2PO4of 0．15%,pH of 6-7,temperature of 20℃-30℃．The incubation period is 4 d-7 d．The biological characteristics of U.maydis were studied to understand the suitable nutrient conditions and environmental conditions of mycelium growth and reproduction,and to provide reference for the development and utilization of U.maydis．

Ustilago maydis;culture medium;growth rate

S646.9

A

1003-8310（2017）04-0026-06

10．13629/j．cnki．53-1054．2017．04．007

翟璐（1993-），女，在读硕士研究生，主要研究方向为中药分析。E-mail:174759250＠qq．com

*通信作者：王淑敏（1965-），女，教授，博士生导师，主要从事药用微生物物质基础与药效学研究以及中药分析学研究。E-mail: 446097156＠qq．com

2017-05-12