雷诺嗪对豚鼠心室肌细胞钠离子电流的影响△

王国涛，白 焱，范秀玲，于淋淋

（大庆市第四医院心内科，黑龙江大庆163712）

雷诺嗪对豚鼠心室肌细胞钠离子电流的影响△

王国涛，白 焱，范秀玲，于淋淋

（大庆市第四医院心内科，黑龙江大庆163712）

目的 探讨雷诺嗪对豚鼠心室肌细胞Na+电流的影响。方法 用酶解方法分离豚鼠心室肌细胞，应用全细胞膜片钳技术记录钠离子电流，分成4组记录不同剂量雷诺嗪给药前、后Na+内向电流变化。结果 雷诺嗪1 μmol/L、10 μmol/L对豚鼠心室肌细胞Na+通道电流均无明显的抑制作用；雷诺嗪100 μmol/L对豚鼠心室肌细胞Na+通道电流均具有明显的抑制作用，并呈剂量依赖性。结论 雷诺嗪减少Na+通道电流的作用，可能为其抗心肌缺血及心律失常的作用机制之一。

雷诺嗪；心室肌细胞；钠离子电流

雷诺嗪（ranolazine）为一种治疗心绞痛的新型药物，用于单一和辅助治疗稳定型心绞痛。作为一种有效的抗缺血药物，雷诺嗪早期被认为是部分脂肪酸氧化酶抑制剂，现有试验证明雷诺嗪可以防止钠离子超载和由钠离子超载引起的钙离子超载。近年研究表明，其机制可能与选择性的抑制晚钠离子通道有关，有研究证实其减少晚钠离子通道的开放，逆转动作电位的延长，抑制早期后除极，终止室性心动过速，有抗心律失常作用［1］。那么，雷诺嗪是否对快钠离子通道同样具有抑制作用？本实验应用膜片钳技术观察雷诺嗪对豚鼠心室肌细胞钠离子电流进行研究，证实大剂量雷诺嗪，能抑制快钠离子通道，有类似Ⅰ类抗心律失常药物的作用，可能是其抗心律失常作用的靶点之一。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

1.1.1 实验动物 雌雄不拘，购于吉林大学实验动物部，体质量250～300 g。

1.1.2 分组 选取不同豚鼠的32个中等大小的心室肌细胞，分为4组，每组8个细胞。（1）正常对照组（control group）：等容量0.9%氯化钠溶液；（2）雷诺嗪小剂量组：雷诺嗪1 μmol/L-1；（3）雷诺嗪中剂量组：雷诺嗪10 μmol/L-1。（4）雷诺嗪大剂量组：雷诺嗪100 μmol/L。

1.2 药品与试剂

1.2.1 雷诺嗪 雷诺嗪购自Sigma公司。

1.2.2 贮存液（mmol/L） KOH 70，L-谷氨酰胺（L-glutamine acid）50，KCl 40，牛磺酸（Taurine）20，KH2PO420，MgCl2·6H2O 0.5，葡萄糖 10，4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）10，乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）0.5。用KOH将贮存液pH值调至7.4。

1.2.3 细胞外液（mmol/L） Nacl 120，CsCl 5，四甲基氢氧化铵（TEA）20，CoCl 3，MgCl22.5，4-氨基吡啶（4-AP）5，葡萄糖 10，蔗糖 20，4-羟乙基哌嗪乙磺酸5。用KOH将细胞外液pH值调至7.4。

1.2.4 细胞内液（mmol/L） CsCl 130，MgCl22，CaCl21，EGTA 11，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，磷酸肌酸10，三磷酸腺苷5。用CsOH将细胞内液pH值调至7.2。

1.3 电极制备

用卧式微电极拉制器（日本Narishige公司产品）于室温（22℃～24℃）条件下拉制微电极，电极电阻为1.5～2.5 MΩ。

1.4 实验方法

1.4.1 豚鼠心室肌细胞分离方法 豚鼠击头部致昏后，迅速开胸取出心脏，置于有钙台氏液中。行主动脉插管，于室温（20℃～22℃）下依次逆向灌流有钙台氏液2 min、无钙台氏液5 min，含胶原酶的无钙台氏液（0.16 mg/mL）6 min。然后从房室沟处剪下心室部分，用眼科剪将心室肌剪成小碎块，置于盛有贮存液的烧杯中，在37℃的水浴箱中轻轻振荡10 min，吸取上清液于离心管中，离心5 min后弃去上清液，加入贮存液，置于4℃冰箱中存放2 h待用［2-3］。

1.4.2 豚鼠心室肌细胞钠离子电流的记录 在常规全细胞状态下进行测定。保持电压为-80 mV，指令电压从-80 mV开始，以10 mv步阶跃至+50 mV，脉冲持续68 ms，刺激频率为0.5 Hz，可记录到豚鼠心室肌细胞的INa+电流。ICa，L由加入到细胞外液的0.1 mmol/L的CdCl2所阻断，KCl由CsCl所取代，消除了K+电流造成的影响。原始电流曲线用nA表示，电流电压（I/V）关系曲线用峰值内向电流除以该细胞的电容（pA/pF）的电流密度表示。

1.4.3 实验分组 为避免细胞间的差异，实验为给药前、后自身对照比较，细胞形成全细胞缝接后，在电压钳模式下记录正常和给药后的钠离子电流。实验分为4组：细胞形成全细胞缝接后记录的第一组电流为对照组，以后通过微量加样器使培养皿中药物的最终浓度分别达到1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L，以观察药物对钠离子电流的影响。

1.5 统计学分析

所有的数据均由计算机直接输出，实验数据用（）表示。同一变量自身前后对照采用配对t检验；多组之间参数两两比较应用单因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD检验，根据给药前、后不同电压水平下的最大激活电流绘制钠离子通道的I-V曲线。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 钠离子快通道的电生理特性

对照组将保持电压控制在-100 mV，阶跃命令为+10 mV，持续时间30 ms，钠离子通道在极化至-50～-60 mV时被激活，最大内向峰值钠离子电流在-40 mV为（110.28±12.12）pA/pF，电流对河豚毒素（TTX）敏感，50 μmol/L可抑制大部分电流成分，表明为河豚毒素敏感的钠离子电流（见图1）。

图1 快钠离子通道的电生理特性

2.2 雷诺嗪对豚鼠心室肌Na+通道的影响

当加入雷诺嗪1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L 3 min后，与正常对照组比较，小剂量峰值INa+电流量和中剂量峰值INa+电流量分别为［（99.50±11.13）Fvs.（96.38±10.35 F）］，差异无统计学意义（P>0.05），大剂量峰值INa+电流量为（79.88±9.88）F，与中、小剂量峰值电流量比较，差异有统计学意义（P<0.05），翻转电位约在+10～-20 mV（见图2）。中、小剂量雷诺嗪对快钠离子通道电流无影响，大剂量雷诺嗪可抑制快钠离子通道电流。

图2 雷诺嗪1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L对豚鼠快钠离子通道的影响

3 讨论

在之前的实验中，已经证实雷诺嗪可降低动作电位时程［4］，并可抑制缺血再灌注所诱发的心律失常［1］，我们推测，其可能与阻滞Na+、K+、Ca2+通道有关。那么在接下来的实验中，我们利用全细胞膜片钳技术，记录豚鼠心室肌细胞钠离子通道电流，来验证我们的设想是否正确。实验结果表明，大剂量雷诺嗪可明显抑制快钠离子通道，中、小剂量对快钠离子通道无明显昨用，有浓度依赖性抑制作用。

钠离子通道广泛分布于可兴奋细胞中，多数对钠离子通道选择性拮抗剂河豚毒素敏感［5］。心肌0期去极化的Na+通道是快通道，其开放时间仅为10～20 ms左右［6］，具有去极化心肌细胞膜、传播动作电位的作用。哺乳动物的心室肌细胞属快反应细胞，0相膜电位从-80～90 mV在1～2 ms内去极化到40 mV左右，主要是电压依赖性的快钠离子通道激活。该相的产生主要因为大量Na+内流，导致膜电位迅速升高去极化，之后引起钙通道开放，使Ca2+内流，以及钾通道的开放使细胞复极化。因而钠离子通道在维持细胞的兴奋性及正常的生理功能上非常重要。

Ⅰ类抗心律失常药物的作用机制［7-8］是通过阻滞钠离子通道可以提高动作电位的发生阈值，0相除极速度减慢、兴奋性降低、动作电位幅度减小、降低迟后除极的发生、延长动作电位的有效不应期等。由此，我们可以推断雷诺嗪抗心律失常的作用机制可能与其抑制钠离子通道电流有一定的关系，实验结果表明，雷诺嗪可阻断钠离子电流增加的作用。大剂量雷诺嗪可以抑制快钠离子通道，有Ⅰ类抗心律失常药物的特性；中、小剂量对快钠离子通道无明显作用。大剂量雷诺嗪可明显抑制钠离子通道，进而改善缺血心肌心功能及抑制心律失常。

［1］王国涛，张文杰，杨萍.雷诺嗪对豚鼠在体心肌缺血/再灌注损伤心律失常及舒张功能的保护作用研究［J］.中国心血管病研究，2011，9（4）：299-302.

［2］周亮，曾晓荣.豚鼠心肌细胞急性酶分离的方法［J］.四川生理科学杂志，2000，22（2）：35-36.

［3］张培华，马季骅.豚鼠心室肌细胞急性分离法中的要则［J］.中国病理生理杂志，2005，21（4）：742-771.

［4］王国涛，张文杰，杨萍.盐酸雷诺嗪对豚鼠心室乳头肌动作电位及收缩力的影响［J］.中国实验诊断学，2010，14（4）：499-502.

［5］KIRSCH G E.Na+channels： structure， function， and classification［J］.Drug Develop Res，1994，3（3）：26-35.

［6］罗自强，余承高.心脏的生物电活动//姚泰，罗自强主编.生理学（7年制规划教材）［M］.北京：人民卫生出版社，2001：105.

［7］杨宝峰主编.药理学［M］.6版.北京：人民卫生出版社，2003：209-214.

［8］Working Group on Arrhythmias of the European Society of Cardiology.The Sicillian gambit.A new approach to the classification of antiarrhythmic drugs based on their actions on arrhythmogenic mechanisms.Task Force of the Working Group on Arrhythmias of the European Society of Cardiology［J］.Circulation，1991，84（4）：1831-1851.

Effects of ranolazine on sodium ionic currents of ventricular myocytes in guinea pigs

WANG Guo-tao，BAI Yan，FAN Xiu-ling，YU Lin-lin
（Department of Cardiology，The Fourth Hospital of Daqing，Daqing，Heilongjiang 163712，China）

Objectives To explore the effects of ranolazine on sodium ionic currents of ventricular myocytes in guinea pigs.MethodsWe applied enzyme solution methods to separate the ventricular muscle cells of guinea pigs.Sodium cur⁃rents were recorded by using whole cell patch clamp technique.Na+introverted currents were recorded before and after administering different doses of ranolazine.ResultsNa+channel currents of ventricular myocytes in guinea pigs had shown no obvious inhibitory effect in the 1 μmol/L and 10 μmol/L ranolazine groups.Na+channel currents of ventric⁃ular myocytes in guinea pigs had shown obvious inhibitory effect in the 100 μmoL/L ranolazine group，and in which the effect had shown a dose-dependent relation.ConclusionsRanolazine reducing Na+channel current may be one of the mechanism of anti-myocardial ischemia and antiarrhythmia.

ranolazine；ventricular muscle cells；sodium current

R541.7

A

1007-9688（2017）03-0319-03

10.3969/j.issn.1007-9688.2017.03.19

2016-09-06）

黑龙江省自然科学基金青年基金项目（项目编号：QC2011C090）；大庆市指导性科技计划项目（项目编号：szdy-2015-101）。

王国涛（1971-），男，主任医师，研究方向为心力衰竭及冠脉介入治疗研究。