怀有先天性心脏病胎儿孕妇血浆microRNA的表达差异

梁小碧，潘 微，张智伟，钟诗龙

［1.广州市妇女儿童医疗中心心脏中心，广州 510120；2.广东省心血管病研究所广东省人民医院（广东省医学科学院），广州510800］

怀有先天性心脏病胎儿孕妇血浆microRNA的表达差异

梁小碧1，潘 微2，张智伟2，钟诗龙2

［1.广州市妇女儿童医疗中心心脏中心，广州 510120；2.广东省心血管病研究所广东省人民医院（广东省医学科学院），广州510800］

目的 检测血浆miRNA在怀有先天性心脏病（先心病）胎儿的孕妇和怀有正常心脏胎儿的孕妇之间的表达差异，筛选出表达显著差异的miRNAs，为产前筛查先心病提供生物标记物和为先心病的发生机制研究提供分子生物学依据。方法 采集60例怀有先心病胎儿的孕妇及60例对照组的血样标本，用Solexa测序方法筛选出具有显著差异性的血浆miRNA。结果 Solexa测序结果显示，在病例组及对照组中分别检测出545个及580个miRNA的表达，以拷贝数≥30，病例组与对照组相比miRNA表达差异倍数≥9为标准，筛选出7个表达上调的miRNA：hsa-miR-137、hsa-miR-206、hsa-miR-224-3p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-5094、hsa-miR-653-3p；4个表达下调的 miRNA：hsa-miR-100-3p、hsa-miR-188-5p、hsa-miR-190a-3p、hsa-miR-216a-5p。结论 怀有先心病胎儿的孕妇血浆中存在miRNA表达差异。

先天性心脏病；microRNA；孕妇；表达差异

先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）是引起婴幼儿残疾或死亡中最常见的出生缺陷［1］，目前，胎儿CHD的产前筛查基本依靠孕中期或孕晚期的胎儿心脏超声检查［2］。然而，目前CHD的产前检出率较低与较迟，致使CHD的出生率、流产率、死胎率、死产率居高不下。CHD的发生机制尚不清楚。miRNA是一类非编码小分子单链RNA，通过调节蛋白编码基因的表达而对不同的细胞发育起到重要的调控作用［3-4］。而循环miRNA异常表达会导致生理的异常及疾病的产生。而循环miRNA可丰富而稳定地存在于体液中，在疾病状态下，循环miRNA的表达谱有特征性的改变，可作为一种无创伤性生物标志物，有助于疾病的预测、诊断和预后。目前，国内、外有关CHD与miRNA研究尚未见相关报道。本文利用Solexa测筛选出表达差异的miRNA，为产前筛查CHD提供生物标记物和为CHD的发生机制研究提供分子生物学依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选择2013年4月至2014年5月在广东省心血管病研究所心儿科超声心动图室确诊为怀有CHD胎儿的孕妇60例为病例组（孕周20～28周）。在检查完的1个月后，打电话进行随访，明确胎儿的转归。另外，选择同期在广东省人民医院产科门诊确诊为怀有正常心脏胎儿的孕妇60名为对照组（孕周20～28周），孕周、年龄与病例组相匹配。所有参加者均有知情同意。

1.2 试剂及仪器

1.2.1 试 剂 血液（液体样本）miRNA快速提取试剂盒（离心柱型）：北京百泰克生物技术有限公司；氯仿、无水乙醇：广州化学试剂厂；Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix：Fermentas公司；dNTP（10 mmol/L）、RNase Free 水：TaKaRa公司。

1.2.2 仪 器 NanoDrop 1000：Thermo Scientific公司；Eppendorf Microcentrifuge台式离心机：Eppendorf公司；Eppendorf 58 1OR Centrifuge冷冻离心机：Eppendorf公司；超低温冰箱：Formascientific。

1.3 实验流程

每1例入组孕妇留取全血标本10 mL，分离血浆。病例组中60例孕妇，每1例取30 μL血浆，组成总血浆池，然后提取血浆总RNA，制备出病例组RNA池。用同样方法制备对照组RNA池。以Solexa测序法分别研究病例组和对照组的miRNA表达谱。

1.4 实验方法

1.4.1 血浆样品收集及miRNA的提取 采集病例组和对照组的外周血，离心后保存血浆，使用血液（液体标本）miRNA提取试剂盒（离心柱型），按照试剂盒说明书提取miRNA，紫外分光光度计定量检测miRNA浓度和纯度。

1.4.2 miRNA测序及表达差异的miRNA筛选 选取病例及对照组的样品混合池（pool），提取血浆miRNA后送广州基迪奥生物进行Solexa测序，分析测序结果，以hsa-miR16（在人血浆含量丰富，表达稳定）作为参照校正表达量，以拷贝数≥30，病例组较对照组表达差异的miRNA差异倍数≥9为标准，筛选异常表达的miRNA。

1.5 统计学分析

应用SPSS 16.0软件进行统计学分析。采用Kolmogorov-Smirnov法进行正态性检验，并进行Levene方差齐性检验。符合正态分布的计量资料以（）表示，偏态分布资料以中位数、四分位数间距M（P25～P75）表示；若计量资料满足正态分布及方差齐性则检验方法选用t检验或方差分析；若计量资料不满足正态分布及方差齐性条件，则选用秩和检验，两组间比较采用两独立样本比较的Wilcoxon秩和检验，随机区组设计多个样本比较采用Friedman M检验。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 提取的血浆miRNA浓度和纯度检测结果

提取的血浆miRNA在280 nm处有最大吸收峰，260 nm/280 nm比值介于1.67～2.17之间；RNA浓度介于15.1～30.8 ng/μL之间。

2.2 miRNA测序结果分析

Solexa测序结果显示，在病例组及对照组中分别检测出389个及517个miRNA的表达，以hsamiR16（在人血浆中含量丰富，表达稳定）作为参照校正表达量，以拷贝数≥30，病例组较对照组表达差异的miRNA差异倍数≥9为标准，筛选7个表达上调的 miRNA：hsa-miR-137、hsa-miR-206、hsa-miR-224-3p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-5094、hsa-miR-653-3p；4个表达下调的 miRNA：hsa-miR-100-3p、hsa-miR-188-5p、hsa-miR-190a-3p、hsa-miR-216a-5p（表1）。

3 讨 论

CHD是引起婴幼儿残疾或死亡中最常见的出生缺陷，虽然近20年来对于CHD的诊治水平已经有了很大的提高，但无可否认的是，其发病率依然是居高不下，而其中一部分的术后存活者，仍会遗留下相当高的并发症和病死率，导致个人及家庭的生活质量严重下降。粗略统计，我国每年CHD的手术量约为4万多例，其中复杂性的CHD的比例高达20%。因此，我国每年CHD的诊疗费可至少达120亿元，多数为手术及其康复所需费用［5-6］。

对我国目前的状况而言，CHD的产前筛查基本依靠中孕期甚至晚孕期的胎儿心脏超声检查［7］。然而，通常目前CHD的产前检出率较低与较迟［8］，这就致使CHD的出生率和流产、死胎、死产率居高不下，预后不良型CHD出生率未得到有效控制，同时，一些可治愈性的CHD由于没有在产前得到早期的诊断，而失去了在新生儿时期或者婴幼儿期的早期治疗机会［9］。

表1 表达差异的11个miRNA

由于胎儿超声心动图筛查对于CHD的诊断存在缺陷性，因此，寻找具有功能性的、更早期的、更加精确的胎儿CHD产前筛查的生物标记物成为当前优生优育学研究的重点、热点与难点。

MiRNA是一类长度约22个核苷酸（nt）的非编码小分子单链RNA，广泛地调控着靶基因的表达，miRNA的异常表达将会导致身心的异常和某些疾病的产生，故它可以作为疾病的生物标记物应用于临床的诊断。循环miRNA丰富而稳定，血浆miRNA也易于获得，在身心异常或者疾病状态下，血浆miRNA的表达谱可有特征性的改变，可作为一种良好的无创伤性生物标志物使用于疾病的预测和诊断，并为疾病的发病机理研究提供科学依据和奠定实验基础。

最近研究发现，母体的循环miRNA与胎儿的生长发育关联密切［10］。2013年，Chen等［11］发现孕妇外周血中存在特异性的胎盘miRNA，经验证后，他们发现在孕期与产后的比照中，miR-141和miR-14的表达量具有明显差异性，miR-141的表达量与孕周及胎盘成正相关。后续研究发现，孕妇外周血中的胎盘特异性的miRNA来源于胎盘合体滋养层细胞，其具有强的稳定性。2013年，Kotlabova等［12］又报道了孕妇血浆中4个新发现的胎儿miRNA与先兆子痫相关，其分别是mir-516-5p、mir-517、mir-520、mir-518，研究表明这几个miRNA的上调有84.6%的可能性会发生先兆子痫，故作者认为其可作为先兆子痫的无创产前诊断的标志物。

如综合前言和上述所言，在身心异常或者某些病理状态下，如果miRNA的表达异常，可导致心脏疾病的发生，且其在体液中存在稳定，可被认为是疾病诊断的良好无创性的诊断生物标志物。据此，我们推测怀有CHD胎儿的孕妇血浆miRNA具有一定的特异性，并可能作为胎儿CHD发病的早期诊断标志物。

本研究通过采用Solexa测序比较怀有CHD胎儿的孕妇为病例组与怀有正常胎儿的孕妇为对照组的血浆miRNA表达差异谱，选取年龄、孕周匹配，建立样品混合池（pool）进行小RNA表达谱分析。Solexa测序结果显示，在病例组及对照组中分别检测出545个及580个miRNA的表达，以拷贝数≥30，病例组与对照组相比miRNA表达差异倍数≥9为标准，筛选出7个表达上调的miRNA：hsamiR-137、hsa-miR-206、hsa-miR-224-3p、hsamiR-34a-3p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-5094、hsa-miR-653-3p；4个表达下调的 miRNA：hsamiR-100-3p、hsa-miR-188-5p、hsa-miR-190a-3p、hsa-miR-216a-5p。从研究结果中可以看出，怀有CHD的孕妇中存在显著表达差异的miRNA。

在我们筛查出来的这11个miRNA中，除了hsa-miR-5094及hsa-miR-653-3p未有相关文献记载其与人类疾病之间的关系，其他的miRNA均有所记载，hsa-miR-137的表达异常和胃肠道肿瘤［13］或者是精神分裂症相关［14］；hsa-miR-224 的表达异常和肝癌［15］、淋巴瘤［16］等相关；hsa-miR-485-3p 的表达异常和乳腺癌［17］、前列腺癌［18］相关；hsa-miR-100-3p已被证实是多种肿瘤标记物［19］，例如胃肠道肿瘤、淋巴瘤及乳腺癌等恶性肿瘤，其可用于诊断、疗效评估和预后评估等方面；hsa-miR-188-5p可参与骨骼的生长及发育，其表达异常与骨发育不良或者是骨肉瘤等疾病的发生、发展相关［20］；hsa-miR-190a-3p被证实和血管生成相关，特别是在肿瘤转移时，其下调可有效的通过抑制肿瘤内血管生成从而的抑制肿瘤的转移［21］；对于hsa-miR-216a-5p的研究，暂未明确其具体作用，有文献报道其与骨转移瘤形成相关［22］。hsa-miR-34a-3p在心肌的纤维化中起到重要的作用，在心肌纤维化的过程中，通过影响成纤维细胞的活动（其过度表达会增强成纤维细胞的活力），从而促进心肌纤维化形成，反之抑制心肌纤维化形成，故我们考虑hsa-miR-34a-3p对心肌的发生、发展相关的可能性大。而hsa-miR-206被证实和肌肉的分化相关，在心肌分化时，如果hsamiR-206表达异常，则会成形不同的CHD［23］，其又与心力衰竭相关，在动物实验已经证实，其过度表达可通过影响成纤维细胞活动减少从而增强心肌的收缩力及增强心脏功能［24］。

由上述可见，除hsa-miR-34a-3p及hsa-miR-206外，其他几个miRNA均与肿瘤的关系较大，而hsa-miR-34a-3p及hsa-miR-206现已有研究提示其与心脏发育的关系，故本研究认为hsa-miR-34a-3p及hsa-miR-206可能与CHD的发生、发展相关，但其具体的机制尚需要进一步的研究证实。本研究虽具备一定的前瞻性，但其局限性有以下几点：（1）收集病例数相对较少，只有60例病例组及对照组入选，尚不能代表基本人群；且随访时间尚短，未能随访至胎儿出后及生后治疗等；（2）因为该标本获取较为困难，研究中的病例组中筛查出的CHD几乎涵盖所有的CHD，故研究范围相对较大，对其中某种疾病无法特异性的区分；（3）研究中的病例组均为在超声心动图室行胎儿超声心动图后确认为怀有CHD胎儿的孕妇，再进行下一步的实验，因在我国，胎儿心脏超声尚未普及，大部分行胎儿超声心动图的均为有危险因素的孕妇，故样本的总体情况和基本人群有所偏离，会存在基本的误差；（4）本研究在筛查时，选择了与多数文献差异性较大的差异倍数，虽然有一定的文献支持，也使得资料整理方便，但是也在一定程度上损失了一部分的资料；（5）本研究只是初筛了可能与CHD发生相关的miRNA，尚未进行进一步的验证，虽然这11个miRNA中已有文献记载其与疾病的关系，且其中有2个已被提示与心脏发生相关，但未能进一步的在研究中验证其与CHD的关系。

本研究是国内罕见的将miRNA和CHD结合，使用Solexa测序来检测miRNA；提示怀有CHD胎儿的孕妇血浆中miRNA存在表达差异，结合文献分析，本研究认为hsa-miR-34及hsa-miR-206与CHD的发生、发展相关，但其具体的机制尚需要进一步的研究证实。

［1］CHEN J， WANG D Z.micro RNAsin cardiovascular development［J］.J Mol Cell Cardiol，2012，52（5）：949-957.

［2］NISHIO S， KUSUNOSE K， YAMADA H， etal.Echocardiographic screening for congenital heart disease in 8819 children：A report from local community events for children′s healthcare［J］.J Cardiol，2015，66（4）：315-319.

［3］BARTEL D P. MicroRNAs： genomics， biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004.116（2）：281-297.

［4］HE L，HANNON G J.MicroRNAs：small RNAs with a big role in gene regulation［J］.Nat Rev Genet，2004，5（7）：522-531.

［5］HOFFMAN J I，KAPLAN S.The incidence of congenital heart disease［J］.J Am Coll Cardiol，2002，39（12）：1890-1900.

［6］WREN C， RICHMOND S， DONALDSON L.Temporal variability in birth prevalence of cardiovascular malformations［J］.Heart，2000，83（4）：414-419.

［7］HUNTER L E，SIMPSON J M.Simpson，prenatal screening for structural congenital heart disease［J］.Nat Rev Cardiol，2014，11（6）：323-334.

［8］HUNTER L E，SIMPSON J M.Prenatal screening for structural congenital heart disease［J］.Pediatr Cardiol，2008，29（6）：1059-1065.

［9］ARYA B，GLICKSTEIN J S，LEVASSEUR S M，et al.Parents of children with congenital heart disease prefer more information than cardiologists provide［J］.Congenit Heart Dis，2013，8（1）：78-85.

［10］CAMPBELL J D，LIU G，LUO L，et al.Assessment of microRNA differential expression and detection in multiplexed small RNA sequencing data［J］.RNA，2015，21（2）：164-171.

［11］LIU X Q，GAO R F，CHEN X M，et al.Possible roles of mmu-miR-141 in the endometrium of mice in early pregnancy following embryo implantation［J］.PLoS One，2013，8（6）：e67382.

［12］HAFNER M，LANDGRAF P，LUDWIG J，et al.Identification of microRNAs and other small regulatory RNAs using cDNA library sequencing［J］.Methods，2008，44（1）：3-12.

［13］LIU S， CUIJ， LIAO G， etal.MiR-137regulates epithelial mesenchymal transition in gastrointestinal stromal tumor［J］.Tumour Biol，2014，35（9）：9131-9138.

［14］COLLINS A L，KIM Y，BLOOM R J，et al.Transcriptionaltargets of the schizophrenia risk gene MIR137［J］.Transl Psychiatry，2014，4：e404.

［15］ZHUANG L P，MENG Z Q.Serum miR-224 reflects stage of hepatocellular carcinoma and predicts survival［J］.Biomed Res Int，2015，2015：731781.

［16］SONG G，GU L，HE B，et al.Expression of miR-224 in diffuse large B cell lymphoma and its clinical significance［J］.Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi，2014，35（7）：619-622.

［17］HE N，ZHENG H，LI P，et al.miR-485-5p binding site SNP rs8752 in HPGD gene is associated with breast cancer risk［J］.PLoS One，2014，9（7）：e102093.

［18］LUCOTTIS， RAINALDIG， EVANGELISTAM， etal.Fludarabine treatment favors the retention of miR-485-3p by prostate cancercells： implications for survival［J］.Mol Cancer，2013，12（1）：p.52.

［19］QIN C，HUANG R Y，WANG Z X.Potential role of miR-100 in cancer diagnosis，prognosis，and therapy［J］.Tumour Biol，2015，36（3）：1403-1409.

［20］LI C J，CHENG P，LIANG M K，et al.MicroRNA-188 regulates age-related switch between osteoblast and adipocyte differentiation［J］.J Clin Invest，2015，125（4）：1509-1522.

［21］HAO Y，YANG J，YIN S，et al.The synergistic regulation of VEGF-mediated angiogenesis through miR-190 and target genes［J］.RNA，2014，20（8）：1328-1336.

［22］TAI H C，CHANG A C，YU H J，et al. Osteoblast-derived Wnt 1 induced secreted protein 1 increases VCAM 1 expression and enhances prostate cancer metastasis by downregulating miR- 126［J］. Oncotarget， 2014， 5（17）：7589-7598.

［23］WINBANKS C E，WANG B，BEYER C，et al.TGF-beta regulates miR-206 and miR-29 to controlmyogenic differentiation through regulation of HDAC4［J］.J Biol Chem，2011，286（16）：13805-13814.

［24］LIMANA F，ESPOSITO G，D′ARCANGELO D，et al.HMGB1 attenuates cardiac remodelling in the failing heart via enhanced cardiac regeneration and miR-206-mediated inhibition of TIMP-3［J］.PLoS One，2011，6（6）：e19845.

Plasma microRNA expression profiling in pregnant women whose fetus with congenital heart disease

LIANG Xiao-bi1，PAN Wei2，ZHANG Zhi-wei2，ZHONG Si-long2
（1.Guangzhou Women and Children′s Medical Center，Heart Centre，Guangzhou 510120，China；2.Guangdong Cardiovascular Institute，Guangdong General Hospital，Guangdong Academy of Medical Sciences，Guangzhou 510080，China）

Objectives To compare plasma miRNA expression in pregnant women whose fetus with and without congenital heart disease，in order to screen for the miRNAs with significant expression differences to provide biomarkers for prenatal screening of congenital heart disease and molecular biological foundation for the possible biological mechanism of congenital heart disease.MethodsBlood sample of 60 pregnant women whose fetus were diagnosed as congenital heart disease（case group）and 60 pregnant women whose fetus were diagnosed without congenital heart disease（control group）were collected for extracting plasma miRNA.Furthermore，we screened for the plasma miRNA with expression difference by Solexa sequencing.ResultsThere were 545 and 580 miRNA expression respectively in case group and control group by Solexa sequencing，in which the standard was chosen as the miRNA copy number≥30 and more than 9 times in case group compared with that in control group.We screened out 7 miRNAs up-regulated（hsa-miR-137，hsa-miR-206，hsa-miR-224-3p，hsa-miR-34a-3p，hsa-miR-485-3p，hsa-miR-5094，hsa-miR-653-3p），4 miRNA down-regulated（hsa-miR-100-3p，hsa-miR-188-5p，hsa-miR-190a-3p，hsa-miR-216a-5p）.ConclusionsThere were expression differences of miRNA in the plasma of pregnant women whose fetus with congenital heart disease.

congenital heart disease；MicroRNA；pregnant women；differential expression

R541.7

A

1007-9688（2017）03-0282-04

10.3969/j.issn.1007-9688.2017.03.11

2017-01-22）

梁小碧（1988-），女，住院医师，研究方向为小儿心血管病学。

潘微，E-mail:drpanwei@163.com