致死性侏儒症p.R248C突变热点的快速检测和三例TD-Ⅰ型高危胎儿的快速产前诊断

姜煜 潘敬新 郭东炜 艾阳 李荣 蒋玮莹 方群 郭奕斌

论 著

致死性侏儒症p.R248C突变热点的快速检测和三例TD-Ⅰ型高危胎儿的快速产前诊断

姜煜1潘敬新2郭东炜3艾阳1李荣1蒋玮莹1方群4郭奕斌1

目的 针对致死性侏儒症I型（thanatophoric dysplasia typeⅠ，TD-Ⅰ）FGFR3基因的突变热点“p.R248C”，建立快速特异的酶切鉴定法（restriction endonuelease testing，RE）和扩增受阻突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）/RE法，并应用于后续3例疑似TD-I高危胎儿的快速产前诊断，以及时防止患胎出生，同时为今后的胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）打下良好基础。方法首先，针对突变热点p.R248C突变前后的序列特点，选择合适的内切酶“Afe I”，建立酶切鉴定法。其次，设计双错配碱基特异引物结合Apa LI酶切，建立ARMS/RE双重特异鉴定法。对阴性和阳性结果均再用普通引物扩、测的结果进行验证。结果用Afe I酶切FGFR3基因exons（6-7）普通引物的PCR产物（535 bp），正常对照及非p.R248C突变的TD病例均能被切成255 bp和280 bp 2个片段，而胎1～胎3均切出255 bp、280 bp和535 bp 3个片段。用特异引物E7（p.R248C）扩增，正常对照和非p.R248C突变的TD病例均扩增阴性，无法进一步做酶切鉴定；而p.R248C突变均扩增阳性，当再用Apa LI酶切PCR产物（365 bp）时，胎1～胎3均切出22 bp和343 bp 2个片段。通过引物扩、测结果显示：胎1～胎3均是p.R248C杂合突变。结论该法快速特异、准确可靠，可用于p.R248C突变热点的快速检测及含该突变高危胎儿的快速产前诊断。该法还可用于含p.R248C突变TD-I型家系的PGD。胎1～胎3都是TD-I患胎，建议尽早终止妊娠。

致死性侏儒症I型；FGFR3基因；p.R248C突变；ARMS/RE法；快速检测；产前基因诊断

致死性侏儒症（thanatophoric dysplasia，TD，MIM187600）又称致死性骨发育不良，是一种先天性、致死性的新生儿骨发育不良病，为常染色体显性（autosomal dominant，AD）遗传，该病主要表现为四肢显著短小，肋骨极短，胸廓极度狭窄，四肢外旋或外展，呈蛙式体态，腹部膨胀，巨颅，前额隆凸，脑部畸形等［1-4］。新生儿发生率国内报道约为 1/40 000［3］，国外报道为 1/20 000～1/50 000［5］。患胎多半胎死腹中或于出生后不足24 h即因重症急性呼吸衰竭而夭折。TD分TD-I和TD-II 2型，其中，TD-I型约占85%，主要表现为股骨短而弯曲，无三叶草状颅骨［6］；TD-II型约占 15%，长骨短、弯曲及椎骨扁平均较I型为轻，患儿股骨较直，颅骨为典型三叶草状［7］。不同类型或同一类型的不同患者，其病程进展是不同的［8-9］，但一年存活率几乎为 0［10］。

TD是由成纤维细胞生长因子受体3（fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3）基因发生病理突变所致，目前已报道的FGFR3基因的突变类型有12种［6-7］。其中p.R248C错义突变为TD-I最高发的致死突变，突变率高达55%以上［11］。因此针对该突变热点，建立快速特异检测方法具有重要的实用价值。本文对高发突变的TD病例进行了详细的方法学研究，并应用所建立的快速特异检测法对3例疑似TD-I型的高危患胎进行了快速产前诊断，均获得成功。

1 材料与方法

1.1 研究对象

近年来，我室先后接诊疑似TD-I的高危胎儿多例，这些病例、家系分别来自广东、甘肃、黑龙江、河南等地，由各附属医院转诊而来，本文重点介绍其中3例。其中，家系3曾引产多次。各病例产前超声检查资料如下所述。

【病例1】孕妇23岁，妊娠22周，2011年超声检查发现：胎儿双顶径55 mm，头围195 mm，胸围120 mm，腹围171 mm，胸围/腹围=0.7，股骨长 16 mm，羊水最大深度42 mm。胎儿双顶径、头围与孕周相符，但胸廓狭小，股骨短而弯曲，拟诊TD。

【病例2】孕妇24岁，妊娠23+3周，2014年5月超声测值：胎儿双顶径63 mm，头围227 mm，腹围233 mm，股骨长径17 mm，肱骨长径16 mm，羊水最大前后径62 mm。胎儿超声结构描述：胎儿四肢可见，双侧股骨、胫腓骨、肱骨、尺桡骨均缩短。省级医院二维+彩超+三维复查结果：胎儿发育相当于22孕周。胎儿多发异常：（1）软指标异常：鼻骨缺失，枕后皮层增厚。（2）骨骼系统异常：四肢极短小，弯曲（相当于15周）；头型异常——苜宿草状；胸廓狭小；脊柱向右侧侧弯；双手、双足小。拟诊TD。

【病例3】孕妇前后共孕育3次患胎，本次实验样品取自第三胎。第一胎于2011年行超声检查：中孕期胎儿彩超，Ⅲ级产前超声检查：双顶径70 mm（28周），头围245 mm，胸围132 mm，腹围 200 mm（24周），股骨长径23 mm（17周），肱骨长径20 mm（16周），足长40 mm，羊水指数211 mm。超声结构描述：头颅增大，前额前凸；胸腔狭窄，胸围缩小，心胸比值增大（〉0.6），腹部相对膨隆，胸围/腹围比值缩小（〈0.89）；胎儿四肢各长骨均可见，但双手呈握拳状，长骨明显缩短、弯曲，所有长骨长度均低于正常值的4倍标准差；羊水偏多。提示致死性骨发育不全改变。第二胎于2013年行超声检查：中孕期胎儿彩超，Ⅲ级产前超声检查：双顶径55 mm，头围200 mm，腹围180 mm，股骨长径40 mm，肱骨长径39 mm，羊水指数150 mm。超声估计平均胎龄：22周4天，胎儿体重（532±135）g。胎儿四肢各长骨均可见，但双手呈握拳状。第三胎于2014年行超声检查：中孕期胎儿彩超，Ⅲ级产前超声检查：双顶径62 mm，头围215 mm，腹围187 mm，股骨长径22 mm，肱骨长径19 mm，羊水指数218 mm。超声结构描述：头颅增大，胸腔狭窄，胸围缩小，双肺隐约可见，肋骨明显缩短，腹部相对膨隆。胎儿四肢各长骨均可见，但双手呈握拳状，长骨明显缩短、弯曲，所有长骨长度均低于正常值的4倍标准差；羊水位于该孕周第96百分位数。拟诊TD。

本论文研究已得到中山大学伦理委员会的批准，所有受检者均完全知情同意。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA模板的制备

胎儿标本（羊水或脐血）和正常对照标本DNA的提取，按试剂盒说明书的步骤操作或采用本室已建立的方法进行［12-13］。

1.2.2 普通引物和特异引物的设计及PCR扩增

以NM_000142作为FGFR3基因的参考序列，用Primer Premier 5.0软件自行设计引物。普通引物的名称、序列及扩增条件见表1。特异引物的设计思路：根据扩增受阻突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）［13］原 理 ，针 对c.742C〉T/p.R248C突变后的序列为“……GTGCTCCCCGCACCGGCCCATCC……”，我们人为增加一个错配碱基，把下游引物设计成能被“Apa LI”内切酶识别的特异引物“GTGCACCCCGCACCGGCCCATCC”，其中“GTGCAC”正好能被 Apa LI（G TGCAC）酶解。特异引物的名称、序列及扩增条件见表1。引物由北京六合华大基因科技有限公司广州分公司合成，聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）纯化。

表1 FGFR3基因exon 7的普通引物和特异引物及PCR条件Table 1 Common primer and specific primer of exon 7 inFGFR3gene and PCR condition

1.2.3 酶切鉴定（restriction endonuelease tesing，RE）

1.2.3.1 普通引物PCR产物的Afe I酶切鉴定

取正常对照、非p.R248C突变的TD病例、胎1～胎3共5个样品的普通引物的PCR产物各7 μL，然后在每一管中依次加入 Buffer（10×）2 μL、Afe I（10 U/μL）1 μL，补充三蒸水至 20 μL，于37℃酶切 30～60 min，然后 65℃ 20 min终止反应，所得酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3.2 特异引物PCR产物的Apa LI酶切鉴定（ARMS/RE法）

取扩增阳性（胎1～胎3）的PCR产物各7 μL，然后依次加入 Buffer（10×）2 μL、Apa LI（10 U/μL）1 μL、补充三蒸水至 20 μL，于 37℃酶切 2～3 h，然后于65℃20 min终止酶切，所得酶切产物用1.8%～2%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.4 测序鉴定

将普通引物及特异引物的扩增产物交北京六合华大基因科技有限公司广州分公司用ABI PRISM 3730型测序仪完成双向测序。

2 结果

2.1 普通引物的PCR产物的Afe I酶切结果

如图1所示，泳道lane简写成L，L1：100 bp Marker，L2、L4、L6、L8、L10 分别是N（正常标本）、M（非 p.R248C 突变）、胎 1（F1）、胎 2（F2）、胎 3（F3）用普通引物扩增的产物（535 bp），L3、L5、L7、L9、L11分别是N、M、F1、F2、F3用Afe I酶切的结果。正常和非p.R248C突变序列能被酶解，均切成255 bp和280 bp 2个片段（L3和L5），而p.R248C的突变序列无法被酶解，所以杂合子经Afe I酶切后，均产生 255 bp、280 bp和535 bp 3个片段（L7、L9和L11）。

图1 AfeI酶切鉴定p.R248C突变Figure 1 Enzyme identification of p.R248C mutation withAfeI

2.2 特异引物的PCR产物的Apa LI酶切结果

如图 2所示，M：100 bp Marker；L1：正常对照（扩增阴性）；L2、L4、L6：胎1、2、3（杂合子，未切）；L3、L5、L7：胎 1、2、3（杂合子，已切）；L8：非p.R248C突变的病例（扩增阴性）。特异引物的扩增产物为365 bp，3例患胎酶切后均产生22 bp和343 bp 2个片段。

2.3 测序结果

2.3.1 普通引物的测序结果

见图3，①～④依次是：正常对照、胎1、胎2、胎3的FGFR3 E（6-7）部分序列比对图。①的正常对照为纯合序列C/C，②～④的胎1～胎3均为杂合序列C/T。经分析证实，患胎1～3的FGFR3基因均存在c.742C〉T/p.R248C杂合突变，为已报道的TD-I型的致病性突变。

图2 Apa LI酶切鉴定p.R248C突变Figure 2 Enzyme identification of p.R248C mutation withApaLI

图3 普通引物扩增产物的部分正向序列比对图Figure 3 The partial forward sequence alignment figure of the products amplified by using common primers

2.3.2 特异引物的测序结果

如图4所示，图4的①～③分别代表：普通引物的正常纯合序列（为C，T）、普通引物的杂合突变序列（为C/T，T）、特异引物的双错配序列（为T，A）。第③排PCR产物的第312～317 bp含有我们设计的Apa LI单切点G TGCAC。“T”是突变的碱基，“A”是我们人为错配的。从上述结果来看，经过特异引物扩增后，单错配的突变序列就会转变成含有Apa LI酶切位点的新序列，从而为随后的酶切鉴定奠定了基础。

图4 普通引物和特异引物的扩增产物的测序结果Figure 4 The sequencing results of the products amplified by using the common primer and specific primer respectively

3 讨论

TD-I型是一种先天性、致死性的AD遗传的短肢畸形病，通常胎死腹中或出生后不久即夭折。本病具有较典型的临床、影像学和病理学特征。超声检查是目前产前诊断本病的主要方法，但容易把TD与成骨不全Ⅱ型（osteogenesis imperfecta typeⅡ，OI-Ⅱ）、Ⅷ型（osteogenesis imperfecta typeⅧ，OI-Ⅷ）、软骨不发育Ⅰ型和Ⅱ型（achondrogenesis typeⅠand typeⅡ，ACG-Ⅰ和ACG-Ⅱ）、窒息性胸廓发育不良（asphyxiating thoracic dysplasia，ATD）等相混淆，故需产前基因检测方能确诊。TD-I型危害严重，至今尚无有效的治疗措施，快速检出突变、阐明病因进而对高危胎儿实施产前基因诊断是目前确诊及防治该病的最佳应对策略，也是开展早期产前诊断和胚胎植入前诊断的必要前提条件。

虽然本病多为散发病例，但近年来我室发现不少有遗传背景的家系，如家系3父母曾连续数胎孕育致死性侏儒症患胎，推测与父或母的生殖腺存在杂合突变嵌合体有关。对于有遗传背景的家系来说，自然受孕生出TD-I患胎的风险非常大，因此，最好采用胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）方法辅助生育。而进行PGD对检测时间有严格要求，需在24 h内完成遗传病的诊断，否则会影响植入和胚胎的存活，虽然目前已有新技术可采取囊胚期取卵裂球进行检测，延长了胚胎体外检测的时间，然而对于那些要求或需要在卵裂期植入胚胎的诊断来说则仍需严格控制时间，RE鉴定以及ARMS/RE双重特异鉴定全程只需3～4 h即可作出确诊，大大节省了检测时间，故特别适用于PGD。此外，由于TD-I是致死性的侏儒症，通常都要引产，故若能越早确诊，就越能减轻引产对孕妇的身心伤害。

建立RE法，是根据R248C突变前后序列的改变导致了酶切点的改变而设计的。对于E（6-7）普通引物来说，扩增产物为535 bp，突变前的正常序列是“CACAGAGCGCTCCCCG”（含有一个Afe I“AGCGCT”酶切位点，能被Afe I切开），而发生c.742C〉T突变后，序列变为“AGTGCT”，该Afe I酶切位点消失，故正常序列可被切出255 bp和280 bp 2个片段，而纯合突变无法被酶解，仍是535 bp；杂合子可切出255 bp、280 bp、535 bp 3个片段。因此实验结果中杂合患胎会显示3个片段。因此，用此酶即可鉴定有无p.R248C突变以及突变是杂合突变还是纯合突变。此处正常样品是作为阳性对照，而纯合突变作为阴性对照。

建立ARMS法，是因为它特异、快速、廉价，一次PCR即可鉴定。特异引物的扩增产物为365 bp，该引物对于突变序列来说，仅有1个碱基（即T〉A）是错配的，而对于正常序列来说，则有2个碱基的错配（即C〉T和T〉A）。因此在控制好扩增条件时，就能让单错配的突变序列扩增阳性，而双错配的正常序列扩增阴性。阳性产物由于含有能被Apa LI识别的酶切位点（G TGCAC），因此扩增后可进一步用Apa LI作酶切鉴定，以提高其准确性和可靠性。又由于杂合子突变其中一条是正常序列，无扩增产物，故杂合突变和纯合突变一样，酶切后均是产生22 bp和343 bp 2个片段。若要鉴定杂合突变和纯合突变，则可用普通引物鉴定，结果如上所述。

对于酶切鉴定，现有快切酶，5～10 min即可完成鉴定，故只要试剂质量保证，用上述二法均可在半天内完成高危胎儿的快速产前诊断，尤其对于没有测序仪的基层单位特别适用，因此本法具有推广应用价值。

本文关于RE及ARMS/RE法的成功建立和产前诊断的成功实施为今后继续开展本病以及其他相关遗传性骨病的快速产前基因诊断积累了宝贵的经验，奠定了良好的基础。

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Fast detection of thanatophoric dysplasia typeⅠp.R248C mutation hot spots and rapid prenatal diagnosis of three TD typeⅠhigh-risk fetuses

JIANG Yu1，PAN Jingxin2，GUO Dongwei3，AI Yang1，LI Rong1，JIANG Weiying1，FANG Qun4，GUO Yibin1
（1.Department of Medical Genetics，Zhongshan School of Medicine，SUN Yat-sen University，Guangzhou，Guangdong，China，510080；2.Department of Internal Medicine，the Second Affiliated Hospital，Fujian University of Medical Science，Quanzhou，Fujian，China，362000；3.Clinical Medicine，Medical College，Xiamen University，Xiamen，Fujian，China，361102；4.Fetal Medicine Center，the First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou，Guangdong，China，510080）

Objective To build up the specific rapid methods of RE and ARMS/RE for mutation hotspot“p.R248C”in the FGFR3 gene of thanatophoric dysplasia type I(TD-I),then use the method for rapidprenatal diagnosis of 3 follow-up high-risk fetuses of TD-I to stop the birth of suffering fetuses,at the same time,lay a good foundation of preimplantation genetic diagnosis(PGD)for the future. Methods First,according to the characteristics of the sequence of the mutation hot spot p.248C before and after mutation,the appropriate enzyme“Afe I”was selected to establish the identification method of enzyme digestion.After that,specific primers of double mismatch bases were devised,combining the method of digestion of Apa LI(ARMS/RE)to achieve the double identification.In the end，the sequences obtained by common primers were used to verify the negative and positive results through DNA sequencing. Results For the normal control and the patient without p.R248C mutation of TD-I，PCR products(535 bp)of exons(6-7)of FGFR3 gene,amplified by common primers,could be digested into 2 fragments(255 bp and 280 bp)by Afe I.However,for fetuses 1～3,the PCR products could be digested into 3 fragments(255 bp,280 bp and 535 bp).The normal control and the patient without p.R248C mutation of TD-I were negative using the specific primers E7(p.R248C),which could not be further identified by enzyme digestion.For the fetuses with p.R248C mutation of TD-I,PCR products(365 bp)of exon 7 of FGFR3 gene,amplified by specific primers,could be digested by Apa LI and all the digested products were 22 bp and 343 bp.Sequencing results of common primers’products indicated:fetuses 1～3 were p.R248C heterozygous mutation. Conclusions The method is fast,accurate and reliable,which can be available for the fast detection of mutation hot spot p.R248C and the rapid prenatal diagnosis of high-risk fetus with p.R248C mutation.This method can also be applied to PGD of high-risk fetus of TD-I with the mutation“p.R248C”.For the 3 high risk fetuses have been diagnosed with TD-I,the clinic suggested termination of pregnancy as soon as possible.

Thanatophoric dysplasia type I;FGFR3 gene;p.R248C mutation;ARMS/RE;Fast detection;Prenatal gene diagnosis

闽粤合作科研基金（71010025）

1.中山大学中山医学院医学遗传室，广东，广州510080

2.福建医科大学附属第二医院内科，福建，泉州362000

3.厦门大学医学院临床医学专业，福建，厦门361102

4.中山大学附属一院胎儿医学中心，广东，广州510080

郭奕斌，E-mail:aguoabin@qq.com

注：姜煜和潘敬新为并列第一作者