佛山市南海区地中海贫血基因类型分析

谢煜楠 杨发达 黄广强 黄勇

佛山市南海区地中海贫血基因类型分析

谢煜楠 杨发达 黄广强 黄勇

目的 通过调查佛山市南海区地中海贫血基因的基因类型和构成比，了解本地区的地中海贫血基因型的分布，为防控本地区重型地贫的出现提供依据。方法采用gap-PCR法检测--SEA/αα，-α3.7/αα，-α4.2/αα 3种常见缺失型α地贫；采用反向斑点杂交法，可以检测αQSα，αCSα，αWSα 3种常见突变型α地贫；采用反向点杂交法检测 β-地贫常见的17种点突变，包括-29、-28、17、βE、41-42、43、71-72、654、Int、14-15、27/28、Ⅰ-1、Ⅰ-5、31、-30、CAP、-32。结果检测 α-地中海贫血缺失型1 359例标本，检出阳性标本490例，阳性率为36.06%（490/1359）。主要缺失类型是--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα；进行α-地中海贫血突变型检测的有1 210例，阳性率为2.8%（35/1 210）。进行β-地中海贫血突变型检测的有1 073例，阳性率为24.98%（268/1 073），主要类型是CD41-42、IVS-Ⅱ-654、CD17、-28；共检出41例复合型地贫，其中α缺失合并α突变的有4例，α-地贫合并β-地贫有37例。结论本研究为佛山市南海区的遗传咨询和制定该地区人群筛查的地贫预防计划提供了有价值的基础资料。

地中海贫血；基因型；构成比

地中海贫血（以下简称地贫）又被称为海洋性贫血或珠蛋白生成障碍性贫血，是一组严重威胁人类健康的致死，致残的遗传性血液病，是世界上最常见及发病率最高的单基因遗传病［1］。我国南方地区各地报道的地中海贫血基因缺陷率为2.5%～20%，而广东及广西两省地中海贫血基因缺陷发生率高达 15.20%［2］及 21.09%［3］，两省地中海贫血的病例数占全国总数的2/5以上，因此，地中海贫血已经成为广东等高发地区社会性公共卫生问题［4］。目前本病尚无有效治疗方法，携带者检查及产前基因诊断是唯一防止新的患儿出生，提高人口素质的有效措施。本文通过回顾2015年在我院进行的地中海贫血基因检测资料，探讨南海地区各种地中海贫血基因突变的类型及构成比，对于贯彻优生优育，提高人口素质具有重大意义。

1 资料与方法

1.1 标本来源

选取2015年1月～2015年12月来我院进行地中海贫血基因检查的患者（包括婚检、产检、体检人群）。其中婚检和产检夫妇单方或（和）双方中有地贫筛查阳性。平均红细胞体积（mean corpuscular volum，MCV）〈82 fL或（和）平均红细胞血红蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）〈27 pg。

1.2 标本的采集与处理

采集待检者的静脉血标本2 mL于EDTA-K2真空抗凝采血管中，充分摇匀抗凝。如当天检验则按试剂盒说明书进行DNA提取的前处理，如不能当日检验则放置4℃冰箱中保存，保存期限为7 d。

1.3 检测试剂来源及方法学

我室使用的是亚能生物技术（深圳）有限公司提供的全套地中海贫血基因检测试剂盒，包括以下检测内容。

α-地中海贫血缺失型检测试剂盒，采用gap-PCR法，可检测--SEA/αα，-α3.7/αα，-α4.2/αα 3种常见缺失型类型。α-地中海贫血突变型检测试剂盒，采用反向斑点杂交法，可以检测αCSα，αQSα，αWSα 3种常见突变型。β-地中海贫血突变型检测试剂盒，采用反向点杂交法，可以检测β-地贫常见的17种点突变，包括-29、-28、17、βE、41-42、43、71-72、654、Int、14-15、27/28、Ⅰ-1、Ⅰ-5、31、-30、CAP、-32。

1.4 检测方法

按试剂盒提供的试剂使用说明书进行操作。

1.5 检测结果的判断

1.5.1 α-地中海贫血缺失型检测结果判断

①正常：检测样品只有一条1 826 bp的正常条带。②缺失杂合子：检测样品有2个条带，若其一为1 826 bp的正常条带，其二为某一缺失型的条带，则结果为此相应缺失型的杂合子；若无正常条带，结果为这种缺失型的双重杂合子。③缺失合纯子：检测样品只有一条缺失型条带，无正常条带，结果为此相应缺失型的纯杂合子。

1.5.2 α-地中海贫血突变型检测结果判断

膜条设3个正常对照点（QSN、CSN、WSN），根据膜条上蓝色斑点显现的位置，读取相应位置上标注的基因型信息。

1.5.3 β-地中海贫血突变型检测结果判断

2.2 患者甲状腺结节消融区液化性坏死发生时间与临床表现 11 枚甲状腺结节消融区液化性坏死发生于术后 14～28 d，4 枚发生于术后 29～35 d，3 枚发生于术后第 36 天。18 枚甲状腺结节消融区液化性坏死的首发症状均为消融区相应颈部体表皮肤红肿变硬，并非消融针穿刺点红肿（图1A），肿胀多继续加重，局部隆起，最后红肿范围扩大直至覆盖穿刺点，其中 6例患者颈部皮肤破溃后有黄白色黏稠液体从原皮肤穿刺点流出（图1B）；最严重者可形成颈部肿块状隆起，并可见皮肤多处破溃（图1C）。18例患者均无发热等全身症状，血常规示白细胞计数及比例均在正常范围。

膜条设7个正常对照点（41-42N、654N、-28N、71-72N、17N、βEN、31N），根据膜条上蓝色斑点显现的位置，读取相应位置上标注的基因型信息。

1.5.4 α-地贫-β-地贫复合型检测结果判断

同时检出有α-缺失型/或α-突变型与β-地中海贫血的患者判断为复合型地贫。

2 结果

2.1 α-缺失型地贫、α-突变型地贫和β-突变型地贫的检出结果

进行α-地贫缺失型检测的有1 359例，进行α-地贫突变型检测的有1 210例，进行β-地贫突变型检测的有1 073例，其各型地贫检出的结果见表1。

2.2 缺失型α-地贫基因型检出情况

对490例α-缺失型地贫进行了--SEA/αα，-α3.7/αα，-α4.2/αα，HKαα 4种基因型检测，检测结果见表2。

2.3 突变型α-地贫基因型检出情况

在35例确诊为α-非缺失型地贫中，进行了αCSα，αQSα，αWSα 3种常见的突变基因型检测，其结果见表3。

2.4 β-地贫基因型检测结果

在268例确诊为β-地贫标本中，进行了β-地贫常见的17种点突变检测，共检出11种基因型，其中β突变合并α缺失/突变的有37例。其检出结果见表4。

3 讨论

地中海贫血是由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋白链合成减少或缺如，使形成血红蛋白的α-链/非α-链比例失衡，而导致的一组遗传性溶血性疾病［5］。根据珠蛋白肽链合成受到抑制的类型，地中海贫血可以分为 α-、β-、δβ-和 δ-型地贫等类型，其中α-和β-地贫较为常见。

表1 α-缺失型地贫，α-突变型地贫，β-突变型地贫的检出结果Table 1 The detection of α-thalassemia，α-thalassemia non-missing，β-thalassemia

表2 490例α-缺失型地贫基因型检测结果Table 2 The detection of 490 cases of α-thalassemia gene deletion type

表3 35例α-突变型地贫基因型检测结果Table 3 The detection of 35 cases of α-thalassemia non-missing gene deletion type

α地贫是由于α珠蛋白基因突变引起的，它可分为缺失型和非缺失型2种类型，我国人群中最常见的3种缺失型α-地中海贫血，分别是--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα，最常见的 3 种突变型 α-地贫分别是αCSα、αQSα、αWSα。本次检出α-地贫525例（包括缺失490例和突变35例）。南海地区人群中最常见的α 缺失类型是--SEA/αα（67.96%），其次为-α3.7/αα（17.14%）和-α4.2/αα（9.18%），前3种占的比例为94.28%，与既往有关佛山地区的报道相似［6-7］。最常见的 α 突变类型是 αQSα/αα（34.29%），αWSα/αα（28.57%），αCSα/αα（34.29%），3种突变频率比较接近，这与陈淑芬等［8］的报道有点出入，可能与检测例数还不够多有关。另外我们发现一例携带有HKαα基因的样本，丰富了南海区的临床材料。HKαα基因是-α3.7和αααanti4.2不等位交换形成，基因型 HKαα/αα 易被诊断为-α3.7/αα［9］，判断时应加以区别。

表4 268例β-突变型地贫基因检测结果Table 4 The detection of 268 cases of β-thalassemia gene deletion type

β地贫是由β珠蛋白基因突变引起，目前发现的β地贫基因突变超过200种，在中国已报道有48种，其中中国南方报道有46种［5］。本次研究共发现β基因型11种，最常见的β突变类型是β41-42/βN（44.40%），β654/βN（19.03%），β17/βN（12.69%），β-28/βN（11.19%），南海地区前4种β突变占总例数的87.31%，广东省和省内的研究资料数据［9-12］接近，但后2个突变类型的构成比又有些差别；与罗娟莉［13］的福建省 β地中海贫血主要类型为β654/βN（41.13%）、β41-42/βN（29.00%）、β17/βN（13.42%）和刘富华［3］的广西地区β地中海贫血主要类型β41-42/βN（46.89%）、β17/βN（20.20%）、β654/βN（14.97%）有所不同。研究表明，南海区的β地中海贫血的突变类型与广东省内的相符，但同时又与其他地区有着一定的区域性差别，这符合了它具有明显的地域性和异质性的特点［1］。另外，发现一例罕见型的β地中海贫血基因突变（CD17），丰富了临床研究资料。

本次研究没把MCV作为全部受检人群的初筛指标，原因是MCV虽然对地贫初筛的灵敏度较高，但对-α3.7/αα、-α4.2/αα基因型存在一部分漏诊，对静止型α/轻型β地贫漏诊极大部分［14］，影响了地贫的检出率。何云英等［15］在佛山地区1 514例地中海贫血基因型分析中报道α地贫的漏诊率达3.04%，其中以3.7型、4.2型、WS型3种类型最易漏诊。潘干华等［16］在1 392例血液学筛查指标阴性人群中检出地中海贫血基因携带者漏诊率为5.39%，且均为静止型α地中海贫血。

佛山是地中海贫血的高发地区之一，佛山市政府从2007年开始，对佛山市户籍人员实行免费婚前地贫筛查和产前地贫筛查，南海区从2016年1月开始，对于孕前优生的血常规检查出MCV〈82 fL和（或）MCH〈27 pg的人员进行免费的地中海贫血基因诊断，对于夫妇双方基因诊断确诊为都携带有α地贫或都携带有β地贫的孕妇进行抽取羊水或脐血进行产前基因诊断。我院作为南海地中海贫血筛查中心，承担了大部分的地贫基因检测任务，可以大大地减少重型地贫患儿的出生，有效地提高出生人口素质［6］。以往对地中海贫血基因型研究的文献大多都只做α-缺失和β-突变，本研究对α-突变也做了统计，数据更全面，本研究通过大量的临床数据阐明了南海区的地贫基因类型和频率，结合本地区基因型分布特点，制订符合当地的地贫防控策略和技术流程，对于本地区地中海贫血的遗传咨询，携带者筛查，优化产前诊断，提高人口素质有一定的参考价值。

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Analysis on genotypes with thalassemia in Nanhai of Foshan

XIE Yunan ，YANG Fada，HUANG Guangqiang，HUANG Yong
(Department of Clinical Laboratory，Nanhai District Maternal and Child Health Hospital of Foshan City，Guangdong,China,528200)

Objective The study aimed to investigate the genotypic distribution of thalassemia by examining the genotype and composition ratio of the thalassemia gene in the Nanhai district of Foshan city,providing a basis for prevention and control of the emergence of severe thalassemia in the region. Methods gap-PCR method was utilized to detect--SEA/αα,-α3.7/αα,-α4.2/αα 3 common gene deletions in α gene mutations.Reverse dot blot techniques were applied to detect αQSα,αCSα,αWSα 3 common mutation sites in non-missing type α -thalassaemia.The reverse dot blot method was applied to detect 17 common mutation sites in β -thalassaemia,including-29,-28,17,βE,41-42,43,71-72,654,Int,14-15,27/28,Ⅰ-1,Ⅰ-5,31,-30,CAP,and-32. Results 1 359 persons with α-thalassaemia were examined,and the positive rate was 36.0%(490/1 359).The main missing types were-SEA/αα,-α3.7/αα,and-α4.2/αα.1 210 persons with α-thalassaemia nonmissing type were examined,with a corresponding positive rate of 2.8%(35/1 210).The main types were αCSα/αα,αQSα/αα,and αWSα/αα.1 073 persons with β-thalassaemia mutants were examined.The positive rate was 24.98%(268/1 073)and the main types were CD41-42,IVS-Ⅱ-654,CD17,and-28.41 cases of complex gene deletion type were detected,including 4 cases of α deletion combined α mutation and 37 subjects with α -thalassaemia combined β-thalassaemia. Conclusion This study provides valuable basic data for genetic counseling in the Nanhai district of Foshan and to formulate programs for population-based screening for thalassemia prevention.

Thalassemia;Genotype;Composition ratio

佛山市医学类科技攻关项目（2015AB000532）

佛山市南海区妇幼保健院检验科，广东，佛山528200

谢煜楠，E-mail：xynan718@163.com