盐碱胁迫下碱地肤体内的有机酸积累及其草酸代谢特点

麻莹，王晓苹，姜海波，石德成*

(1.长春医学高等专科学校基础医学部，吉林 长春130031；2.东北师范大学国家环境保护湿地生态与植被恢复实验室，吉林 长春130117；3.东北师范大学生命科学学院，吉林 长春130024)



盐碱胁迫下碱地肤体内的有机酸积累及其草酸代谢特点

麻莹1，2，王晓苹3，姜海波2，石德成3*

(1.长春医学高等专科学校基础医学部，吉林 长春130031；2.东北师范大学国家环境保护湿地生态与植被恢复实验室，吉林 长春130117；3.东北师范大学生命科学学院，吉林 长春130024)

本研究对碱地肤幼苗进行盐胁迫或碱胁迫动态处理，通过分析碱地肤的有机酸含量及草酸代谢相关酶活性等指标，以探讨碱地肤的有机酸积累及草酸代谢调控机制的特点。结果表明，随着碱胁迫时间的延长，碱地肤体内草酸等7种有机酸均有所积累，草酸为主的有机酸的大量积累可能与碱胁迫(高pH)密切相关，它们可能起到离子平衡和pH调节的双重作用。碱地肤积累的草酸并非主要来源于抗坏血酸分解途径。此外，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPcase)参与催化的草酰乙酸裂解途径也不是草酸合成的主要途径。实验确定草酸合成的关键酶是乙醇酸氧化酶(GO)。草酸分解的草酸氧化酶(OxO)活性高低不是内源草酸积累量的关键因子。综上推断，碱地肤体内草酸的大量积累与其OxO分解无关，而是主要取决于其合成的GO关键酶。

碱地肤; 盐碱胁迫; 有机酸; 草酸相关酶

资料表明，有机酸不仅具有调节植物细胞Ca2+浓度和pH的作用[1-2]，而且还在植物对缺磷[3]、缺铁[4]的适应性响应中起着十分重要的作用。有机酸代谢调节在植物抵抗各种逆境胁迫中起重要作用[5]。在植物遭受铝害时，植物细胞通常积累有机酸或根系分泌有机酸而减轻或避免铝害[6]。此外，有机酸在植物抵抗镍、铜、铅等重金属胁迫中也起了重要的作用[7]。尽管有关有机酸与逆境胁迫的报道很多，然而有关有机酸与盐、碱胁迫特别是碱胁迫的报道却很少。因此，弄清碱地肤(Kochiasieversiana)有机酸积累特点及其相关代谢调节可能是探讨其适应盐、 碱胁迫机理的切入点。

先前的研究已经表明，草酸是藜科植物碱地肤盐碱胁迫下积累的主要有机酸，它可能就是决定天然抗碱牧草碱地肤既抗盐又抗碱的重要代谢产物[8]。然而，时至今日盐碱生境中碱地肤体内草酸的积累途径还不清楚。如果能弄清其草酸等有机酸积累及草酸代谢途径特点，将对盐碱草原的治理、恢复有着极其重要的科学和经济价值。碱地肤作为一种高度抗盐碱的藜科牧草，它还具有一定的经济价值，其全草及种子均可以当作中药材使用[9]。由于其既具有极强的耐盐碱能力又具有很好经济价值，而成为中国东北地区治理碱化草地的首选牧草之一。

土壤盐渍化已成为限制我国农牧业生产的最大障碍[10]。通常盐碱化土壤既含有中性盐(NaCl、Na2SO4)又含有碱性盐(NaHCO3、Na2CO3)。中性盐胁迫和碱性盐胁迫有着本质的不同，它们的胁迫作用机理和植物对其所作出的生理响应也不同[5]。盐胁迫主要有渗透胁迫和离子胁迫[11]；碱胁迫不仅含有与盐胁迫相同的胁迫因素，还涉及高pH胁迫[12]。

根据中国东北碱化草地土壤含盐特点，本研究分别用中性盐(NaCl、Na2SO4)和碱性盐(NaHCO3、Na2CO3)模拟出盐胁迫或碱胁迫条件，并以此对碱地肤幼苗进行胁迫处理[5]。通过动态监测草酸等有机酸及草酸相关酶活性的变化特点，进一步探讨有机酸积累特点及草酸特殊的代谢调控机制，为弄清碱地肤适应盐碱生境特殊的生理机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料培养

碱地肤种子采集于中国吉林省西部天然草原(44°40′-44°45′ N，123°44′-123°47′ E)。播种于直径17 cm 盛有2.5 kg洗净细砂的塑料花盆内。出苗后每2 d用1/2 Hoagland 营养液透灌1次，其他时间用蒸馏水补偿水分蒸发。每盆定苗16株，试验期间幼苗数量保持不变。整个实验于2013年5月中下旬在室外进行，处理期间人工遮雨。

1.2 盐胁迫和碱胁迫条件

根据中国东北盐碱化草原土壤所含盐分的特点，将2种中性盐NaCl和 Na2SO4以1∶1摩尔比混合作为盐胁迫组，将2种碱性盐NaHCO3和Na2CO3以1∶1摩尔比混合作为碱胁迫组[5]。盐、碱胁迫组的总盐浓度均为200 mmol/L。这样保证两种胁迫处理液的Na+浓度和总离子浓度相同，只有pH不同，而且碱胁迫组溶液的pH值与典型的碱地肤生境的pH值相近(9.80～10.10)[8]。以不含胁迫盐的Hoagland营养液作为对照。盐胁迫组、碱胁迫组和对照组溶液的pH分别是6.58，9.96及6.56。

1.3 胁迫处理

苗龄6周后，选取66盆长势一致的碱地肤苗，随机分为22组，每组3盆为3次重复。其中8组为只浇营养液在不同时间点(0、16、24、36、48、72、96、144 h)取样的对照组(CK)。另外7组为用中性盐处理不同时间(16、24、36、48、72、96、144 h)取样的盐胁迫组。其余7组为用碱性盐处理不同时间(时间点同中性盐组)取样的碱胁迫组。含有相应浓度胁迫盐的营养液作为处理液，每盆用500 mL处理液透灌，每天2次(早7：00和晚6：00)，使植株处于完全胁迫状态；对照组只浇500 mL营养液。试验重复3次[5]。

1.4 取样

分别按不同处理时间(0、16、24、36、48、72、96和144 h)逐盆取出碱地肤植株，先冲洗干净其根部；之后分别用自来水、蒸馏水冲洗植株，再用滤纸吸干植株表面水分。在子叶痕处剪开，将植株分成茎叶和根2个部分，分别称取2个部分的鲜重(fresh weight, FW)。分别称取0.2 g新鲜成熟叶片，用于草酸相关酶活性测定。分别称取5 g茎叶部分冻干，用于草酸等有机酸的含量测定。其余鲜样85 ℃，杀青15 min后，40 ℃下真空干燥至恒重，记录干重(dry weight, DW)。

1.5 生理指标测定

1.5.1 草酸等有机酸含量测定 分别称取以上100 mg冻干样品，10 mL无离子水分多次加入研磨提取，3000 r/min，离心10 min，收集上清液，反复3次合并上清液并用无离子水定容至50 mL，用于草酸等有机酸含量测定。

草酸等有机酸(除总抗坏血酸外)用离子色谱法测定(美国戴安公司生产DX-300离子色谱系统，CDM-II电导检测器)；其中草酸的测定用 AS4A—SC离子交换柱，流动相为Na2CO3/NaHCO3=1.7/1.8 mmol/L，其他有机酸则用ICE-AS6离子排斥柱，加AMMS-ICE Ⅱ消声器，流动相为0.4 mmol/L 全氟丁酸。总抗坏血酸测定采用2，4-二硝基苯肼法参照国标[13]。

1.5.2 酶活性测定 分别称取叶片0.2 g，加入2 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液 (5 mmol/L MgCl2，0.1% Triton X-100，10% 丙三醇，5 mmol/L EDTA，pH 7.5)，在冰上充分研磨成匀浆后，4 ℃下15000 r/min离心5 min，上清液即为酶提取液，备用。

乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase, GO: EC 1.1.3.1)参照Booker等[14]方法加以修改。1 mL的反应液中含有Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L，pH 7.8)，盐酸苯肼(10 mmol/L，pH 6.8)，0.1 mL酶液，摇匀，水浴30 ℃保温10 min，加入0.1 mL 乙醇酸(用KOH调至pH 7.0)启动反应。室温反应1 min后，连续2 min记录324 nm处吸光值的升幅。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPcase: EC 4.1.1.31)活性参照Yang等[15]方法加以修改。1 mL反应液包含：Tris-HCl(100 mmol/L，pH 8.4)，100 mmol/L NaHCO3，25 mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)，5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L NADH，2U苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH)混匀，30 ℃水浴10 min，加入酶液启动反应。室温下连续3 min记录340 nm处吸收值的降幅。

异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase, ICL: EC 4.1.3.1)活性测定参照Brock等[16]方法加以修改。1 mL反应液中包含：2 mmol/L 二硫苏糖醇，2 mmol/L 异柠檬酸钾，2 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 盐酸苯肼，50 mmol/L KH2PO4(pH 7.0)。摇匀，25 ℃保温10 min，用酶液启动反应，1 min后连续记录3 min内324 nm处吸收值的升幅。

草酸氧化酶(oxalate oxidase, OxO: EC 1.2.3.4)活性测定参照Thakur等[17]方法加以修改。2 mL反应液：80 μmol琥珀酸钠(pH 5.0)，1 μmol CuSO2，1 mmol/L 草酸和酶液。40 ℃反应5 min后，加入1.0 mL显色试剂(0.4 mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0；每100 mL显色剂包含100 mg 苯酚，50 mg 4-氨基吡啉，1 mg 辣根过氧化酶)，在室温黑暗中反应15 min，记录波长520 nm处的吸光值，参照H2O2标准曲线计算H2O2含量。

以上酶活性测定以不加酶液作空白对照。酶提取液的蛋白质含量采用Bradford (1976)[18]方法测定。酶活性用1 mg酶蛋白1 min内生成产物或消耗底物的nmol或μmol数量表示。

1.6 数据处理

用 Excel作图，数据处理及方差分析等采用SPSS 13.0程序完成。所有数据均用3次重复数据的平均值及其标准误(S.E.)表示，检验水平为P<0.05。采用 LSD法在0.05水平上进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 盐、碱胁迫对碱地肤茎叶草酸等有机酸含量的影响

表1分别显示了在盐、碱胁迫下碱地肤茎叶的草酸等有机酸的含量变化情况。在非胁迫条件下，草酸含量并无明显变化(P>0.05)；而随着盐、碱胁迫时间的延长，草酸含量均显著升高(P<0.05)，碱胁迫下，草酸最大积累量是对照(0 h)的3.02倍，而盐胁迫下，其最大值是对照(0 h)的1.28倍，可见，盐、碱胁迫均不同程度地促进草酸的积累，而碱胁迫对它的积累作用更大。

表1 盐、碱胁迫对碱地肤茎叶有机酸含量的影响Table 1 Effects of salt and alkali stresses on the organic acid content in the shoots of K. sieversiana μmol/g FW

注：用200 mmol/L中性盐(NaCl∶Na2SO4=1∶1; pH 6.58)和200 mmol/L碱性盐(NaHCO3∶Na2CO3=1∶1; pH 9.96)处理苗龄6周的碱地肤0～144 h。表中数据均为3次测定的平均值±SE。同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：Six-week-old seedlings ofK.sieversianawere treated with salt (NaCl∶Na2SO4=1∶1; 200 mmol/L; pH 6.58) and alkali (NaHCO3∶Na2CO3=1∶1; 200 mmol/L; pH 9.96) stresses for 0-144 h. Data in the table are the average of three determinations (±SE). Different letters within the same column show significant difference (P<0.05).

在非胁迫条件下，苹果酸是仅次于草酸的第二大有机酸(表1)。盐胁迫对苹果酸的含量影响不大(P>0.05)；而碱胁迫处理24 h后，其含量骤然增加(P<0.01)，胁迫96 h时其含量达到顶峰(其含量是0 h的14.3倍)。

从表1可以看出，随着盐、碱处理时间的延长，柠檬酸含量均显著升高(P<0.01)，且碱处理 (F=37.13)的影响明显大于盐处理(F=5.75)，然而柠檬酸的最大积累量仅为草酸最大积累量的17.09%。可见，柠檬酸的作用也远不及草酸。

在非胁迫条件下，抗坏血酸的含量随着时间的延长略有升高的趋势(P<0.05)，经盐、碱胁迫(胁迫16 h)的抗坏血酸含量表现出暂时性的升高。值得注意的是，在持续96和144 h的碱胁迫下抗坏血酸含量有所下降。这可能与长时间的碱性环境加速其氧化分解有关。但在整个胁迫过程中，碱胁迫处理的含量始终高于盐胁迫。

非处理组茎叶部分甲酸、乙酸、琥珀酸含量极低(分别占干重的0.03%，0.10%，0.06%)。盐胁迫下，它们的含量变化不大(P>0.05)。随着碱胁迫处理时间的延长，三者含量均显著升高(P<0.05)。

从表1整体来看，盐碱胁迫下有机酸的积累量为草酸>苹果酸>柠檬酸，其中草酸是积累最主要的有机酸(其含量占总有机酸含量的60.47%～94.36%)，而甲酸、乙酸、琥珀酸、抗坏血酸等有机酸的积累量并不大，其总量为总有机酸的3.83%～6.43%。可见，甲酸、乙酸、琥珀酸、抗坏血酸等有机酸在碱地肤适应盐碱胁迫的过程中作用甚微。

2.2 盐、碱胁迫对碱地肤叶片中草酸代谢相关酶活性的影响

从图1A可知，盐、碱2种胁迫下碱地肤成熟叶片的GO活性均随胁迫时间的延长呈整体上升的趋势。当盐、碱胁迫时间低于24 h，GO活性变化不明显(P>0.05)；而胁迫时间超过24 h，GO活性均明显升高(P<0.01)，盐、碱胁迫下GO活性最大值分别是对照的1.37和1.84倍，可见，只有盐、碱胁迫时间超过24 h，才会激活GO活性，而碱胁迫下对其激活程度更大。

图1 盐、碱胁迫对碱地肤叶片乙醇酸氧化酶(GO)、异柠檬酸裂解酶(ICL)、磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶(PEPcase)、草酸氧化酶(OxO)活性的影响Fig.1 Effects of salt and alkali stresses on the activities of GO, ICL, PEPcase and OxO in the leaves of K. sieversiana 同一曲线上不同字母表示差异显著(P<0.05)。Different letters on the same curve show significant difference (P<0.05).

如图1B所示，与GO相同，盐、碱胁迫处理下ICL活性均随胁迫时间增加而显著上升(P<0.01)，碱胁迫的升幅高于盐胁迫，而其特殊之处在于其酶活性急剧上升(P<0.01)的时间发生在24和36 h之间，继续增加盐、碱胁迫处理时间，ICL活性升高幅度均不大(盐处理：P>0.05，碱处理：0.01

从图1C可知，盐、碱处理使叶片PEPcase活性升高。24 h以内的盐、碱胁迫对PEPcase活性均无显著影响(P>0.05)；而盐碱胁迫时间超过24 h，其活性均显著增加(P<0.01)，盐、碱胁迫下其酶活性最大值分别是对照的3.95和1.62倍。可见，盐胁迫比碱胁迫更促进PEPcase酶活性的升高。

如图1D可知，盐、碱处理初期(胁迫16 h)叶片中OxO活性均升高，但随盐、碱胁迫时间增加其活性随之降低，特别是胁迫超过24 h后其活性急剧下降。在144 h达到最低，他们分别是对照的39.20%和50.56%，可见，与碱胁迫相比，盐胁迫处理对OxO活性的抑制作用更强。

3 讨论

植物可通过调节自身的生命活动过程来适应盐碱胁迫，植物在其生长过程中不断地积累无机离子及有机化合物，这是植物长期适应盐碱生境而形成的一种适应机制。对于高度抗盐碱牧草碱地肤来说，有机酸可能就是决定其既抗盐又抗碱的重要代谢产物[5]。而碱地肤茎叶的草酸在总有机酸中占有绝对优势的地位(60.47%～94.36%)，因此，草酸是碱地肤茎叶中的主要有机酸，也是盐、碱胁迫下主要积累的有机酸。本实验中随着碱胁迫处理时间的延长，碱地肤体内草酸等7种有机酸含量均明显增加。草酸为主的有机酸的大量积累可能起到离子平衡和pH调节的双重作用[19]。

苹果酸与许多植物的抗逆作用有关[20]，在很多植物中，盐胁迫可诱导苹果酸酶基因的表达和苹果酸酶蛋白的积累[21]，而本实验中苹果酸仅在碱胁迫下积累量剧增(表1)。除草酸以外，苹果酸是碱地肤响应碱胁迫积累的第二大有机酸，可见，苹果酸在碱地肤响应碱胁迫过程中也起到一定的作用。

体内积累有机酸可能是星星草(Puccinelliatenuiflora)[22]、碱地肤[5]等植物适应碱胁迫维持细胞内离子平衡及调节pH的有效途径。禾本科植物星星草仅在碱胁迫下特异性积累柠檬酸，且柠檬酸是星星草积累的主要有机酸[22]。而本实验中随着盐、碱处理时间的延长，碱地肤的柠檬酸积累量明显增加，碱处理的积累量远高于盐处理；而柠檬酸的积累量也远不及草酸(表1)。此外，在盐碱生境下，禾本科的虎尾草(Chlorisvirgata)体内苹果酸的积累量最大，其在虎尾草响应盐碱胁迫中的作用不可忽视[23]。综上可知，在不同植物中，有机酸响应盐、碱胁迫的积累特点不尽相同。

草酸就是碱地肤茎叶中决定其适应盐碱生境的关键物质；盐碱胁迫下碱地肤的草酸主要分布在成熟的功能叶片中[5]。叶片也是植物合成草酸的主要场所[24]，但其合成途径尚不完全清楚。本实验测定了成熟叶片中草酸代谢相关酶的活性。

GO既能催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，还可继续催化乙醛酸生成草酸。而ICL可催化异柠檬酸裂解，其产物之一为乙醛酸[25]，后者又在GO催化下氧化生成草酸。在外施盐、碱胁迫24 h后，GO，ICL的活性均显著升高(P<0.01)，尤其以碱胁迫更为突出。相关分析表明，叶片中GO和ICL酶活性与茎叶部分草酸含量均为正相关关系。但前者的相关度(r=0.739)大于后者(r=0.549)。因此可以说，GO可能在植物合成草酸过程中起着更为重要的作用。这与以往的报道一致[24]。

在许多植物中抗坏血酸分子可裂解后生成草酸和酒石酸[1]，但其生化机制尚不十分清楚。盐、碱胁迫条件下，碱地肤植株各部分均未检测到酒石酸的存在[8]，而且碱地肤草酸含量变化与抗坏血酸的变化不存在显著负相关(盐、碱胁迫下其相关系数r分别为0.483和-0.095) 。此外，碱地肤茎叶中抗坏血酸含量很低，其不足草酸的2%。综上，碱地肤利用抗坏血酸形成草酸的可能性较小。抗坏血酸分解代谢途径并非其草酸积累的主要来源，这与以往的报道不一致[1]。

同位素示踪的方法表明草酰乙酸是草酸形成的前体[24]，在C4植物中，PEP在PEPcase的催化下，羧化生成草酰乙酸。而后者可在草酰乙酸裂解酶的催化下分解生成草酸[26]。而本实验碱地肤茎叶部分草酸含量与叶片PEPcase活性之间成负相关(r=-0.208)。另外苹果酸也是草酸的合成前体[24]，茎叶部分草酸含量与苹果酸含量成显著正相关(r=0.931)，这与Libert等[24]发现的大黄(Rheumofficinale)叶柄中二者含量呈负相关的结果正好相反。综上，可排除碱地肤体内的草酰乙酸或苹果酸是草酸前体的可能。

越来越多的证据表明草酸并不是植物中的一种代谢终产物，它能继续被降解生成 CO2[27]，而OxO可能是植物体内最重要的草酸降解酶。盐、碱胁迫抑制OxO活性，且盐胁迫对OxO活性的抑制大于碱胁迫(图1D)，即盐处理下的草酸分解速率小于碱处理，而盐胁迫下茎叶部分的草酸含量远远低于碱胁迫下(图1A)。此外，草酸含量与OxO活性之间有很小的负相关(r=-0.234)。通过以上事实推断，OxO活性高低即草酸分解作用并不是内源草酸积累量的限制因子，决定草酸积累的主导因素主要是由GO关键酶催化的草酸的合成途径。通过以上事实推断，碱地肤体内草酸的大量积累与其OxO分解无关，而是主要取决于其合成作用，GO又是决定草酸合成的关键酶。

References：

[1] Franceschi V R, Nakata P A. Calcium oxalate in plants: formation and function. Annual Review of Plant Biology, 2005, 56: 41-71.

[2] Volk G M, Goss L J, Franceschi V R. Calcium channels are involved in calcium oxalate crystal formation in specialized cells ofPistiastratiotesL. Annals of Botany, 2004, 93: 741-753.

[3] Ström L, Owen A G, Godbold D L,etal. Organic acid mediated P mobilization in the rhizosphere and uptake by maize roots. Soil Biology and Biochemistry, 2002, 34: 703-710.

[4] López-Bucio J, Nieto-Jacobo M F, Ramrez-Rodrguez V,etal. Organic acid metabolism in plants: From adaptive physiology to transgenic varieties for cultivation in extreme soils. Plant Science, 2000, 160: 1-13.

[5] Ma Y, Guo L Q, Zhang S F,etal. Solutes accumulation and distribution traits of an alkali resistant forage plantKochiasieversianaand physiological contribution of organic acid under salt and alkali stresses. Acta Prataculturae Sinica, 2013, 22(1)：193-200. 麻莹, 郭立泉, 张淑芳, 等. 盐碱胁迫下抗碱牧草碱地肤溶质积累、分布特点及有机酸的生理贡献. 草业学报, 2013, 22(1): 193-200.

[6] Yang J L, Zheng S J, He Y F,etal. Comparative studies on the effect of a protein-synthesis inhibitor on aluminium-induced secretion of organic acids fromFagopyrumesculentumMoench andCassiatoraL. roots. Plant Cell Environment, 2006, 29: 240-246.

[7] Yang H, Yang Z M, Zhou L X,etal. Ability ofAgrogyronelongatumto accumulate the single metal cadmium, copper, nickel and lead and root exudation of organic acids. Journal of Environmental Sciences, 2001, 13: 368-375.

[8] Ma Y, Guo L Q, Wang H X,etal. Accumulation, distribution, and physiological contribution of oxalic acid and other solutes in an alkali-resistant forage plant,Kochiasieversiana, during adaptation to saline and alkaline conditions. Journal of Plant Nutrition and Soil Science, 2011, 174(4): 655-663.

[9] Zhai Y J, Feng X H, Kang Y G,etal. Pharmacognostical identification of fructusKochiasieversiana. Journal Chinese Materia Medica, 1996, 19(6): 283-285. 翟延君, 冯夏红, 康延国, 等. 碱地肤的生药鉴定. 中药材, 1996, 19(6): 283-285.

[10] Peng B, Xu W, Shao R,etal. Growth ofSuaedasalsatin response to salt stress in different habitats. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(4): 81-90. 彭斌, 许伟, 邵荣, 等. 不同生境种源盐地碱蓬幼苗生长发育对盐分胁迫的响应和适应. 草业学报, 2016, 25(4): 81-90.

[11] Xiao G Z, Teng K, Li L J,etal. Antioxidant enzyme activity and gene expression in creeping bentgrass under salt stress. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(9): 74-82. 肖国增, 滕珂, 李林洁, 等. 盐胁迫下匍匐翦股颖抗氧化酶活性及基因表达机制研究. 草业学报, 2016, 25(9): 74-82.

[12] Shi D C, Yin L J. Difference between salt (NaCl) and alkaline (Na2CO3) stresses onPuccinelliatenuiflora(griseb.) scribn. et merr. plants. Acta Botanica Sinica, 1993, 35(2): 144-149. 石德成, 殷立娟. 盐(NaCl)与碱(Na2CO3)对星星草胁迫作用的差异. 植物学报, 1993, 35(2): 144-149.

[13] GB/T5009.86-2003, Determination of Total Ascorbic Acid in Fruits, Vegetables and Derived Products (Fluorometric method and Colorimetric Method)[S]. Beijing: China Standards Press, 2004. GB/T5009.86-2003, 蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定(荧光法和2, 4-二硝基苯肼法)[S]. 北京: 中国标准出版社, 2004.

[14] Booker F L, Reid C D, Brunschon Harti S,etal. Photosynthesis and photorespiration in soybean [Glycinemax(L.) Merr.] chronically exposed to elevated carbon dioxide and ozone. Journal of Experimental Botany, 1997, 48: 1843-1852.

[15] Yang Z M, Yang H, Wang J,etal. Aluminum regulation of citrate metabolism for Al-induced citrate efflux in the roots ofCassiatoraL. Plant Science, 2004, 166: 1589-1594.

[16] Brock M, Darley D, Textor S,etal. 2-methylisocitrate lyases from the bacteriumEscherichiacoliand the filamentous fungusAspergillusnidulans: characterization and comparison of both enzymes. European Journal of Biochemistry, 2001, 268: 3577-3586.

[17] Thakur M, Goyal L, Pundir C S. Discrete analysis of plasma oxalate with alkylamine glass bound sorghum oxalate oxidase and horseradish peroxidase. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2000, 44: 77-88.

[18] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254.

[19] Shi D C, Yin S J, Yang G H,etal. Citric acid accumulation in an alkali-tolerant plantPuccinelliatenuifloraunder alkaline stress. Acta Botanica Sinica, 2002, 44: 537-540.

[20] Alhendawi R A, Römheld V, Kirby E A,etal. Influence of increasing bicarbonate concentration on plant growth, organic acid accumulation in roots and iron uptake by barley, sorghum and maize. Plant Nutrition, 1997, 20: 1731-1753.

[21] Shao H B, Liu Z, Zhang Z B,etal. Biological roles of crop NADP-malic enzymes and molecular mechanisms involved in abioticstress. African Journal of Biotechnology, 2011, 10(25): 4947-4953.

[22] Guo L Q, Shi D C, Wang D L. The key physiological response to alkali stress by the alkali-resistant halophytePuccinelliatenuiflorais the accumulation of large quantities of organic acids and into the rhyzosphere. Journal of Agronomy and Crop Science, 2009, 196: 123-135.

[23] Lv J Q, Li C Y, Yang C W,etal. Effect of natural saline soil on organic acid accumulation in the stem and leaf ofChlorisvirgataand analysis of stress factors. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(4): 95-103. 吕家强, 李长有, 杨春武, 等. 天然盐碱土壤对虎尾草茎叶有机酸积累影响及胁迫因子分析. 草业学报, 2015, 24(4): 95-103.

[24] Libert B, Franceschi V R. Oxalate in crop plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1987, 35: 926-938.

[25] Millerd A, Morton R, Wells J R E. Role of isocitrate lyase in synthesis of oxalic acid in plants. Nature, 1962, 196: 955-956.

[26] Chang C C, Beevers H. Biogenesis of oxalate in plant tissues. Plant Physiology, 1968, 43: 1821-1828.

[27] Hurkman W J, Tanaka C K. Effect of salt stress on germin gene expression in barley roots. Plant Physiology, 1996, 110: 971-977.

Characteristics of organic acids accumulation and oxalate metabolism inKochiasieversianaunder salt and alkali stresses

MA Ying1,2, WANG Xiao-Ping3, JIANG Hai-Bo2, SHI De-Cheng3*

1.DepartmentofBasicMedicine,ChangchunMedicalCollege,Changchun130031,China; 2.StateEnvironmentProtectionKeyLaboratoryofWetlandEcologyandVegetationRestoration,NortheastNormalUniversity,Changchun130117,China; 3.SchoolofLifeSciences,NortheastNormalUniversity,Changchun130024,China

In this study, seedlings ofKochiasieversianawere subjected to different salt and alkali stresses. The characteristics of organic acid accumulation and mechanisms regulating oxalate (OXA) metabolism were investigated by quantifying various organic acids and determining the activities of OXA metabolism-related enzymes. Seven kinds of organic acids (including OXA) accumulated inK.sieversianaunder extended alkali stress. The accumulation of these organic acids was correlated with alkali stress (high pH), suggesting that they play roles in ion balance and pH regulation. The degradation pathway of L-ascorbic acid was not the main source of OXA. The cleavage of oxaloacetate by phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPcase) probably played a minor role in OXA synthesis, but glycolate oxidase (GO) was the key enzyme for OXA synthesis. The activity of oxalate oxidase (OxO) involved in OXA decomposition was not a limiting factor for endogenous OXA accumulation. Taken together, these results showed that OXA accumulation inK.sieversianaunder alkali stress was not because of reduced OXA degradation by OxO, but largely depended on OXA synthesis by GO.

Kochiasieversiana; salt/alkali stresses; organic acid; oxalate-metabolizing enzyme

10.11686/cyxb2016365

2016-09-27；改回日期：2016-12-05

国家自然科学基金资助项目(41271231),东北师范大学教育部重点实验室开放课题(130028691)和吉林省教育厅项目(JJKH20171071KJ)资助。

麻莹(1981-)，女，内蒙古呼伦贝尔人，副教授，博士。E-mail：may635@nenu.edu.cn

*通信作者Corresponding author. E-mail：shidc274@nenu.edu.cn

http://cyxb.lzu.edu.cn

麻莹, 王晓苹, 姜海波, 石德成. 盐碱胁迫下碱地肤体内的有机酸积累及其草酸代谢特点. 草业学报, 2017, 26(7): 158-165.

MA Ying, WANG Xiao-Ping, JIANG Hai-Bo, SHI De-Cheng. Characteristics of organic acids accumulation and oxalate metabolism inKochiasieversianaunder salt and alkali stresses. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(7): 158-165.