猪伪狂犬病三种抗体检测方法的比较

摘 要 为探索满足猪伪狂犬病防治需要、准确、实用的诊断方法，选用乳胶凝集试验、胶体金免疫层析技术、酶联免疫吸附试验三种诊断方法，以求筛选出一种简单、快捷、灵敏、特异的临床检测方法。结果表明：乳胶凝集试验具有敏感、简便、快捷等优点，但其特异性差和假阳性率较高；胶体金免疫试验的成本低廉，对设备的要求不高，但敏感性、特异性等均较差；酶联免疫吸附试验从准确性、灵敏性、特异性等方面都得到比较好的效果。

关键词 猪伪狂犬病；乳胶凝集试验；胶体金免疫试验；酶联免疫吸附试验；抗体检测

中图分类号：S858.28 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.09.054

伪狂犬病（Pseudorabies）是一种由疱疹病毒科α疱疹病毒亚科猪疱疹病毒Ⅰ型引起的家畜和多种野生动物的传染病，猪是本病毒的储藏者和传染源。本病对猪造成的危害最严重，其特征为体温升高、剧烈发痒和急性脑脊髓炎症状，并引发妊娠母猪流产，死胎以及胎儿出生后短期死亡，该病在猪群中具传播快、死亡率高、流行范围广、传播途径多和病原体顽固等特点，每年都给养猪业造成巨大的损失[1]。为了有效预防和控制此病，减少经济损失，保证和促进我国养猪业的健康发展，需一种简便、快捷、敏感性高和特异性强且便于使用的方法。

目前，在猪伪狂犬病诊断方面用得最多的是血清学方法，包括血清中和试验（SN）、乳胶凝集试验（LA）、琼脂免疫扩散试验（AGID）等[2]。通过从某些出现伪狂犬病的典型症状的种猪场采血，分离血清，运用临床上常用的乳胶凝集试验、胶体金免疫试验、酶联免疫吸附试验，现比较和分析3种方法的准确性、敏感性。

1 材料及方法

1.1 材料

从广东某三个大型猪场随机抽样采血，分离血清，编号（1～15），冷冻保存。

诊断试剂：猪伪狂犬病乳胶凝集试验诊断试剂盒、猪伪狂犬病抗体免疫金标测试纸、猪伪狂犬病酶联免疫吸附试验诊断试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 猪伪狂犬病乳胶凝集试验

将疑似猪伪狂犬病的血清、标准阳性血清、标准阴性血清分别作1∶2稀释，各取一滴（10～20 μL）依次加于乳胶凝集板上。各加乳胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1～2 min，于3～5 min内观察结果。以出现“++”以上者判为阳性凝集。

1.2.2 猪伪狂犬病胶体金免疫试验

在检测卡的加样孔内加入2滴50 μL待检血清，将检测卡平放在桌面上，在室温下静置15 min后判定结果。判断标准：阳性，即在观察孔内，检测线区（T）及对照线区（C）同时出现紫红色线，猪伪狂犬病抗体越高，检测线（T）的颜色越深；弱阳性，即在观察孔内，检测线区（T）及对照线区（C）同时出现紫色线，但检测线区（T）出现的色线颜色很浅；阴性，即在观察孔内，只有对照线区（C）出现一条紫色红线；失效，在观察孔内，检测线区（T）和对照线区（C）都不出现色线。

1.2.3 猪伪狂犬病酶联免疫吸附试验

第一，取出酶标板并记录样品在板上的位置。第二，在A1、A2、A3、A4、A5、A6孔内各加未稀释的阴性对照100μL。第三，加100μL已稀释的样品（1∶20）到相应的孔内，每一样品做2个重复。第四，室温作用30 min，洗涤3～5次，再在每一孔内加入100 μL的酶标抗体。第五，室温作用30 min，在每一孔内加入TMB底物溶液100μL。第六，室温显色15 min后，加入100 μL终止液以终止反应。第七，在650 nm测量并记录样品和对照的吸收值。第八，结果判定：阳性对照的平均值（PCx）与阴性对照（NCx）的平均值之差（P-N）大于或等于0.15时试验成立，而且阴性对照平均值（NCx）必须大于或等于0.151。每一样品内针对PRV抗体的有无是由样品与阳性对照的比率（S/P）来确定，比值小于0.4的样品确认为PRV抗体阴性，比值大于或等于0.4的样品确认为PRV抗体阳性。

2 结果

LA、IGFA、ELISA检测结果见表1。试验表明，对15份样品应用LA、IGFA、ELISA方法，同时进行猪伪狂犬病血清抗体检测，结果为：LA检测，11份血清判定为阳性，阳性血清率为73.3%；IGFA试验，10份血清判定为阳性，阳性血清率为66.7%；ELISA试验，12份血清判为阳性，阳性血清率为80.0%。

3 讨论

猪伪狂犬病是阻碍养猪业发展的主要疫病之一，猪感染PRV或免疫之后，产生抗体水平并不高，因此，生产上需要敏感、准确的血清学方法检测[3]。

从以上结果看出，在3种猪伪狂犬病血清学诊断方法中，乳胶凝集试验的敏感性高，但特异性差，检测结果中假阳性较高，但其操作简便，对人员、设备条件要求不高，检测成本低，适合作为流行病学调查、疫病监测以及种猪群检疫净化阳性猪初筛的检验方法使用。

胶体金免疫试验的准确性、敏感性、特异性均不理想，但具有操作简便、设备要求低、检验成本低廉、结果易于判定等优点，进一步完善后，可作为一种适合基层单位大批量快速检疫需要的理想检验方法，具有很好的开发前景[4]。

间接ELISA试验因敏感性高、特异性强等优点而被列为国际贸易指定检测项目之一[5]。目前的试验室及科研机构常用此方法在临床上进行定性和定量检测。

三种试验的符合率都达到了基本的要求，得到了比较好的效果。间接ELISA试验在敏感性、特异性、准确性等方面都明显优于其他两种试验，因而可以作为其他试验结果的参考标准。

目前应用的猪伪狂犬病疫苗均可能干扰现有的血清学检测方法，因此，作为疫病监测和流行病学调查，为确信结果准确，检测前应该先确定检测猪群未使用猪伪狂犬病疫苗免疫；作为科研生物制品厂家，应加强基因缺失疫苗新产品的研制开发和生产，并生产与之配套的诊断试剂；作为种猪场，应在疫苗检测的基础上，确定是否上苗，使用何种疫苗，对监测阳性率不高的种猪场要坚决采取疫病净化的防治措施，确定使用疫苗应选择基因缺失疫苗，为此后的监测和净化留有余地。

参考文献

[1]孙刚，杜宇沛，高忠溶，等.应用琼脂免疫扩散试验检测猪伪狂犬病抗体的研究[J].黑龙江畜牧兽医，2000（4）：8-9.

[2]邱德新，陈焕春，何启盖，等.间接ELISA检测猪伪狂犬病血清抗体[J].中国兽医学报，2002（2）：37.

[3]范纬兴，胡敬东，吴加强，等.猪伪狂犬病病毒A株的分离鉴定[J].中國兽医学报，2003（6）：15.

[4]张志，柳淑芳，赵宏坤，等.猪伪狂犬病的诊断方法研究进展[J].养猪，2000（4）：37-38.

[5]国际兽疫局.诊断试剂和疫苗标准手册[M].青岛：青岛新闻出版局，1996.

（责任编辑：赵中正）

收稿日期：2017-02-18

作者简介：范灿洪（1981—），男，广东佛山人，本科，兽医师，从事兽医工作。