SNaPshot技术应用于云南省部分人群ABO血型基因分型

于书欣，曾发明，金岩章，万洪静，翟滇，邢豫明，程宝文

（1.昆明医科大学，云南昆明 650500；2.云南中医学院，云南昆明 650500；3.云南省公安厅，云南昆明 650228；4.陇川县公安局，云南陇川 678700；5.丽江市公安局，云南丽江 674100）

SNaPshot技术应用于云南省部分人群ABO血型基因分型

于书欣1，2，曾发明1，3，金岩章4，万洪静5，翟滇3，邢豫明1，3，程宝文1，3

（1.昆明医科大学，云南昆明 650500；2.云南中医学院，云南昆明 650500；3.云南省公安厅，云南昆明 650228；4.陇川县公安局，云南陇川 678700；5.丽江市公安局，云南丽江 674100）

目的应用SNaPshot技术对ABO血型进行基因型检测。方法采集107份已知血型（由血清学获得）的云南无关个体静脉血提取DNA，运用SNaPshot Multiplex试剂盒对ABO血型基因的第261、297、681、703、802和803核苷酸位置的6个SNP位点进行复合扩增检测，计算相关遗传学参数。结果107份血样中A、B、OA、OG4个等位基因的频率分别为0.3551、0.1682、0.2300、0.2476，其中AG和顺式AB未检出，ABO基因分型结果与血清学检验的结果一致。结论SNaPshot技术适用于ABO血型基因的分型。

法医遗传学；ABO血型系统；基因检测；SNaPshot技术

ABO等位基因核苷酸序列的成功克隆[1]，为ABO血型在DNA水平上的检测提供了实验基础。ABO血型是法庭科学检测最早的遗传标记之一，不仅存在于血液中，还存在于唾液、毛发、指甲等其他生物检材中，传统的血清学方法抗原抗体反应仅能检测血液中的ABO血型，而SNaPshot技术则可检测除血液之外的如唾液斑、毛发、指甲等各种生物检材的ABO基因型。目前ABO基因分型方法有直接测序聚合酶链式反应-单链构象多态性（polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）[2]、序列特异引物（sequence specific primer，SSP）引导的PCR反应（PCR-SSP）[3]以及使用通用报告引物进行分型等，本研究应用SNaPshot技术对107例外周血进行检测，现将ABO的基因型结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 样本采集及DNA提取

云南107名无关个体的外周血样本由昆明医科大学第一附属医院提供，EDTA-Na2抗凝。

所有血样均采用传统血清学方法[4]获知ABO血型，其结果用作DNA检测方法的对照。用经典的饱和酚-氯仿法提取所有样本的DNA。

1.2 ABO血型SNP位点选择及引物设计

根据Doi等[5]的研究，控制ABO血型的相关基因位于第9号染色体上，ABO基因包含长度范围为28～688bp的7个外显子和长度约为19514bp的6个内含子，本研究选取第6外显子261、297和第7外显子681、703、802、和803共6个SNP位点，其碱基分布特征见表1。根据文献[3]中给出的6个位点的引物进行PCR检测及微测序。

表1 ABO血型6个SNP位点的序列特征

1.3 复合扩增体系建立

采用10μL PCR扩增体系：5U/μL FastStart Taq DNA聚合酶（德国Roche公司）0.3μL，10×FastStart Taq缓冲液（德国Roche公司）1 μL，25 mmol/μL MgCl21μL，2.5mmol/μL dNTP 1μL，多重PCR引物混合液1 μL，去离子水5.7 μL，模板DNA 1 μL。在9700型PCR扩增仪（美国AB公司）上进行扩增，程序如下：95℃10min；94℃1min，65℃1min，72℃1min，35个循环；72℃7min。接着，取5μL PCR扩增产物，加入1 U/μL虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP，德国Roche公司）1μL、10U/μL核酸外切酶（德国Roche公司）0.1 μL和0.5 μL去离子水，在9700型PCR扩增仪上进行扩增，程序如下：37℃30 min，80℃10min，72℃7min。

1.4 SNaPshot检测

采用SNaPshot Multiplex试剂盒（美国AB公司）进行单碱基延伸反应，5 μL体系：SNaPshot复合反应混合液0.3μL，BigDye 5×测序缓冲液1μL，延伸引物混合物1.5μL，多重PCR产物1μL，去离子水1.2μL。在9700型PCR扩增仪上运行如下程序：95℃1min；95℃10s，52℃0.05s，60℃30s，25个循环。获得单碱基延伸产物，在此产物中直接加入1U/μL SAP 1μL和去离子水0.5μL混匀，在9700型PCR扩增仪上运行如下程序：37℃30min，80℃10min，72℃7min。

以GeneScan-120 Liz（美国AB公司）为内标，取1 μL产物加至10 μL甲酰胺-内标混合液［V（甲酰胺）∶V（内标）=200∶1］中，95℃变性3 min，冰浴3 min后上样。

采用3100型遗传分析仪（美国AB公司）进行电泳，使用GeneMapper®ID v3.2软件分析数据，使用Arlequin 3.5软件统计基因型频率，并进行Hardy-Weinberg平衡检验。

2 结果

2.1 SNP分型

经SNaPshot技术，检出的107名云南无关个体ABO血型各等位基因组成的基因型（图1）与应用传统血清学获得的分型一致，等位基因A、B、OA、OG频率分别为0.355 1、0.168 2、0.230 0、0.247 6，AG未检出，顺式AB型未检出。

图1 云南人群ABO血型10种基因型的毛细管电泳图谱

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验

107名无关个体ABO血型的6个SNP位点共组成AA、AB、AOA、AOG、BB、BOA、BOG、OAOA、OAOG、OGOG10种基因型，各基因型频率见表2，经Arlequin 3.5软件统计，P值均大于0.05，显示群体基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。

表2 107个无关个体的ABO基因型频率分布（n=107）

3 讨论

3.1 SNaPshot技术检测ABO血型的频率分布

A和B等位基因的主要变异位点有261、297、681、703、802和803，其中703和803的变异决定了相应的编码氨基酸的变异，从而产生血型转移酶A、B[6]。O等位基因261位点G碱基的缺失导致移码突变而编码无活性的蛋白质产物，其中OA亚型在297位置上有A突变，OG亚型在681位置上有T突变。

ABO血型的基因频率分布与民族、地区有关，我国幅员辽阔，民族众多，血型差异甚大，利用基因分型方法研究ABO血型分布及其基因频率分布，不仅为临床医学提供科学依据，也可为法医日常检案提供群体遗传学基础[7]。本研究采用SNaPshot技术对云南107份血样进行检测，发现基因型AA、OAOG在该人群中频率最高，AOA、BOA两个基因型频率较低。A、B、OA、OG的频率分别为0.355 1、0.168 2、0.230 0、0.247 6，其中A型在云南人群中所占比例最大，5个等位基因的频率分布与Doi等[5]研究的日本无亲缘关系的人群频率分布相一致，O2在中国汉族人群中未发现[8，9]。Itou等[8]研究了世界ABO血型及亚型的分类与分布，发现单倍群A是由等位基因B和O重组形成。

3.2 ABO血型SNP分型的法医学应用

本研究运用SNaPshot技术对107份无关个体血样进行检测，均获得与血清学检验相一致的ABO血型判定结果，表明本研究建立的检测方法准确、可靠。不过，在使用该体系时，由于引物浓度和模板纯度的影响，导致各位点间均衡性较差，有待对引物浓度进行调整进一步完善该体系。

目前，虽然有多种方法可检测SNP位点，如TaqMan[10，11]、基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）[12]和DNA微阵列[13]等技术，但这些技术设备昂贵，普遍适用性不强，而SNaPshot技术所需的毛细管电泳仪在各法医DNA实验室内均有配备，使ABO血型基因型的检测在法医案件中的普及应用成为可能。

3.3 法医学应用价值

SNaPshot技术拓展了ABO血型的应用范围，在个体识别和亲权鉴定的案件中，ABO血型检测不再仅局限于血液的检验，一些非血液检材如毛囊、组织块、羊水、精斑等均可检测出ABO血型的基因型，增加了案件中可用物证检材的种类，大大提高了对犯罪嫌疑人排查的概率；另外，在一些由血液疾病引起的血型抗原表达异常的血型诊断、B（A）等特殊血型诊断[14-16]的案件中，凭借ABO血型基因型的亚型，可为侦查提供方向。

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Genotyping of ABO Blood Group in Partial Population of Yunnan Province by SNaPshot Technology

YU Shu-xin1,2,ZENG Fa-ming1,3,JIN Yan-zhang4,WAN Hong-jing5,ZHAI Dian3,XING Yu-ming1,3, CHENG Bao-wen1,3
（1.Kunming Medical University,Kunming 650500,China;2.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China;3.Yunnan Provincial Public Security Department,Kunming 650228, China;4.Longchuan Public Security Bureau,Longchuan 678700,China;5.Lijiang Public Security Bureau, Lijiang 674100,China）

ObjectiveTo detect the genotype of ABO blood group by SNaPshot technology.MethodsDNA were extracted from the peripheral blood samples with known blood groups（obtained by serology）of 107 unrelated individuals in Yunnan.Six SNP loci of the 261th,297th,681th,703th,802th,and 803th nucleotide positions were detected by SNaPshot Multiplex kit,and relevant genetics parameters were calculated.ResultsIn 107 blood samples,the allele frequencies of types A,B,OA,and OGwere 0.355 1, 0.1682,0.2300 and 0.2476,respectively,while that of types AGand cis AB were not detected.The genotyping results of ABO blood group were consistent with that of serologic testing.ConclusionSNaPshot technology can be adapted for genotyping of ABO blood group.

forensic genetics;ABO blood group system;genetic testing;SNaPshot technology

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.013

1004-5619（2017）03-0277-04

2015-10-20）

（本文编辑：李莉）

云南省社会发展科技计划项目（2008GACA012-7）

于书欣（1987—），女，硕士，主要从事法医物证学研究；E-mail：490103194@qq.com

程宝文，男，博士，主任法医师，硕士研究生导师，主要从事法医物证学、群体遗传学研究；E-mail：ggcbw@vip.sina.com