MALDI-TOF-MS对Y染色体上66个二等位基因的检测

宋雨桐，李莉，张立男，朱如心，柳燕，林源

（1.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；2.华东政法大学，上海 200063）

MALDI-TOF-MS对Y染色体上66个二等位基因的检测

宋雨桐1，2，李莉1，张立男1，2，朱如心1，柳燕1，林源1

（1.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；2.华东政法大学，上海 200063）

目的分析华东地区汉族人群Y染色体上66个二等位基因遗传标记的多态性，并评价其法医学应用价值。方法采用多重PCR联合基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技术对华东地区205名汉族男性无关个体Y染色体上66个二等位基因遗传标记进行分型研究，使用直接计数法统计待测位点的等位基因频率，用公式计算基因多样性和单倍型多样性，用Arlequin v3.5.2.2软件检测该体系的单倍型并且进行群体遗传学比较。结果其中60个二等位基因遗传标记在华东地区汉族男性人群中呈多态性分布，基因多样性为0.0385～0.5019，共检测到85种单倍型，单倍型多样性为0.9703。部分SNP位点的等位基因分布在华东地区汉族人群和新疆汉族人群、广东汉族人群差异具有统计学意义。结论60个二等位基因遗传标记及其检测体系在亲权鉴定和个体识别中可补充提供遗传信息，MALDI-TOF-MS技术可以进行二等位基因遗传标记的分型检测。

法医遗传学；Y染色体；多态现象，遗传；基质辅助激光解吸电离；单核苷酸多态性；插入/缺失

Y染色体为男性特有，Y染色体遗传标记在亲权鉴定中具有独特的应用价值。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）作为第三代遗传标记，近十年来引起越来越多研究者的关注；插入/缺失（insertion/deletion，InDel）多态性位点，是指基因组中插入或缺失不同大小的DNA片段所形成的多态性遗传标记，此两类遗传标记通常为二等位基因遗传标记。常用的SNP分型检测方法有SNaPshot微测序技术[1]、TaqMan探针技术[2]、焦磷酸测序技术[3]和二代测序技术[4]等，上述技术具有步骤繁杂、测定位点单一、仪器设备昂贵等缺点；而分析InDel位点则常用传统的毛细管电泳技术[5]。本研究结合文献报道和实际情况，为完成华东地区汉族人群Y染色体上66个二等位基因遗传标记的多态性分布调查，采用多重PCR联合基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技术进行研究，旨在为法医学应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样本

在知情同意原则下，收集华东地区汉族男性无关个体血液样本205份，取200μL，其余-4℃保存备用。

1.1.2 主要试剂及仪器

QIAamp®DNA Blood Mini试剂盒（德国QIAGEN公司），Complete iPLEX®Gold Genotyping Reagent Set 96试剂盒（美国Agena Bioscience公司）。9700型PCR扩增仪（美国AB公司），MassARRAY®飞行时间质谱仪、MassARRAY®RS1000纳升点样仪（美国Agena Bioscience公司），5810R离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取

应用QIAamp®DNA Blood Mini试剂盒，按说明书提取血液样本中的DNA，-20℃保存备用。

1.2.2 位点的选择、优化及引物设计

根据2008年国际Y染色体协会公布的Y染色体系统树[6]和美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库[7]的检索，筛选出在东亚人群具有多态性［最小等位基因频率（mirror allele frequency，MAF）≥0.01］的72个二等位遗传标记，通过美国Agena Bioscience公司提供的在线工具[8]设计复合引物，并进行预实验，将不适用于MALDI-TOF-MS平台的6个位点删去，最终保留66个位点（包含63个Y-SNP位点和3个Y-InDel位点）进行分型检测。依据各个位点的物理距离，并避免引物相互干扰，分成3个复合体系，分别进行扩增检测，依次命名为W1、W2和W3，各包含29、29和8个位点（表1），分别配置PCR扩增及延伸引物混合液。

表1 3个复合扩增体系所包含的二等位基因遗传标记

1.2.3 PCR扩增

使用Complete iPLEX®Gold Genotyping Reagent Set 96试剂盒分别对上述三个体系进行PCR扩增，扩增体系均为5 μL，包括超纯水1.4 μL、10×PCR缓冲液0.5 μL，25 mmol/L MgCl20.4 μL，25 mmol/L dNTP混合液0.1μL，PCR引物混合液0.5 μL，5 U/μL PCR酶0.1μL，模板DNA溶液2μL。用9700型PCR扩增仪按下列条件进行多重PCR扩增：95℃预变性2 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃60 s，45个循环；72℃延伸5 min。扩增时以2800M（美国Promega公司）作为阳性对照。

1.2.4 产物的纯化

为了去除PCR反应后剩余的dNTP，在上述PCR扩增产物中加入超纯水1.53 μL、1.7 U/μL虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）0.30 μL和 SAP缓冲液0.17μL。在9700型PCR扩增仪上运行下列程序：37℃40min，85℃5min。

1.2.5 单碱基延伸反应

在纯化后的产物中加入超纯水0.62 μL，10× iPLEX®pro buffer plus 0.2 μL，10×iPLEX®pro Termination Mix 0.2μL，单碱基延伸引物混合液0.94μL，iPLEX®酶0.04μL。用9700型PCR扩增仪按下列条件进行单碱基延伸反应：94℃30 s；94℃5 s，52℃5 s，80℃5 s，52℃5 s，80℃5 s，52℃5 s，80℃5 s，52℃5 s，80℃5 s，52℃5 s，80℃5 s，40个循环；72℃延伸3min。

1.2.6 样本脱盐

在单碱基延伸反应产物中加入超纯水41 μL以及风干的洁净树脂15 mg，放在旋转器上颠倒摇匀15min，然后以4400×g离心5min。

1.2.7 点样

使用MassARRAY®RS1000纳升点样仪将上步反应产物点样至SpectroCHIP®Array 96芯片上，调整点样时间和速度，将点样量控制在8～12nL。

1.2.8 MALDI-TOF-MS检测

将点样完毕的芯片放入MassARRAY®飞行时间质谱仪的真空仓中，使用设定好的自动程序进行质谱检测，用MassARRAY Typer 4.0软件（美国Agena Bioscience公司）查看分型结果。

1.3 数据分析

2 结果

表2 66个二等位基因遗传标记的多态性及对照样品（2800M）的基因型（n=205）

2.1 等位基因频率和法医学参数

本研究得到了Y染色体上66个二等位基因遗传标记的等位基因频率数据，其中的60个在华东地区汉族男性人群中具有多态性，各位点的等位基因频率、GD值以及对照样品（2800M）的分型结果见表2。

表2数据显示，在所选择的位点中，除M148、rs11575897、rs2032624、rs2032645、rs9306841、SRY8299这6个位点外，其余60个位点均具有多态性（MAF≥0.01），GD值为0.0385～0.5019，其中rs17269928的GD值最高（0.5019），M111、rs2032602、rs3848982、rs3906、rs9786479的GD值最低（0.0385）。

由于Y染色体上的遗传标记存在连锁，因此实际观察到的单倍型种类数量远远小于统计学上可能出现的组合数[14]。本研究共发现85种单倍型，HD值达到0.9703，其中单倍型频率最高的为0.0927，观察次数是 19；单倍型最低的频率仅为0.0049，观察次数为1。

2.2 群体遗传学比较

本研究中所涉及的66个二等位基因遗传标记中，有19个在张爱平等[11]所建立的复合扩增体系中对广东汉族人群进行过分析；黄代新等[12]曾建立26个YSNP位点检测体系对湖北（武汉）汉族人群进行过检测，与本研究相同的二等位基因遗传标记有23个；本研究的部分二等位基因遗传标记曾经在新疆汉族人群中进行过群体遗传学调查[13]，与上述三组数据进行群体遗传学比较，差异具有统计学意义（P<0.05）的位点见表3。

表3 华东地区与中国不同地区汉族群体部分Y-SNP位点等位基因分布差异比较（P值）

3 讨论

3.1 关于Y-SNP位点的选择

本研究选定的Y染色体上的二等位基因遗传标记既有SNP位点也有少部分InDel位点，没有严格分开的原因为：首先，SNP和InDel位点具有相似的自然突变率，不会影响数据统计；其次，选择的MALDITOF-MS平台的分型原理对这两类位点都适用[15]。因此决定尝试将Y-SNP位点和Y-InDel位点在同一体系中进行分型检测。

与先前报道[11，12]的两个复合扩增体系相比，本次实验所包含的位点个数较多，能提供更多的遗传信息。此外，这66个位点涵盖了《法医SNP分型与应用规范》（SF/Z JD0105003—2015）中建议选择的20个Y-SNP位点中的19个，因此在司法鉴定实务中，具有很高的应用价值。

3.2 关于分型方法的选择

当前的报道[16]中，进行SNP分型检测大都选用SNaPshot微测序技术，该技术较为成熟，在实践中应用较广，但是具有引物设计要求严格、步骤繁复、无法进行高通量分析等局限性。

此外，也有研究人员运用TaqMan探针技术进行SNP分型，该方法灵敏度高，对DNA样本的质量要求较低，适合微量检材的分析，实验过程简单，耗时短。但该技术更适用于大量样本、单个SNP位点分型检测，多用于医学检测[17]，显然与此次研究目的不符。

本研究选择了MALDI-TOF-MS平台，利用最终产物被强激光激发所得离子的质荷比不同，完成SNP和InDel位点的分型检测。该方法具有多个位点同步检测、结果实时读出、数据处理简单快捷等优点，因此可以实现中高通量、自动化操作，在分析大量样本时具有很强的优势。不过，在实验中也发现，当多重PCR体系中位点较多时（如本研究的W1、W2），会有部分位点不能得出分型结果，此时可以采用拆分体系的方法，降低每个体系同时检测的位点数。

3.3 体系的多态性及群体差异

本研究结果表明，所选的66个二等位基因遗传标记中，有60个在华东地区汉族人群中具有遗传多态性，GD值为0.0385～0.5019，其中多态性较高的位点（GD≥0.3）[13]共有15个，多态性中等的位点（0.2≤GD<0.3）共有31个，多态性较低的位点（0.01

由表3可看出，华东地区和新疆汉族人群之间，有5个位点的等位基因分布频率差异有统计学意义（P<0.05）；华东地区与广东汉族人群之间，有13个位点的等位基因分布频率差异具有统计学意义（P< 0.05）；而华东地区和湖北（武汉）汉族人群之间，相同位点的等位基因分布频率差异均无统计学意义（P>0.05）。由此可见，部分Y染色体上二等位基因遗传标记的等位基因分布具有地域性差异。

3.4 应用价值评估

本研究对华东地区205个汉族男性无关个体进行了Y染色体上66个二等位基因遗传标记的分型检测，共检出85种单倍型，HD值为0.9703。虽然系统效能小于当前广泛使用的包含了17个Y-STR基因座的Yfiler试剂盒[18]，但是也能提供较大的遗传信息量，在涉及男性的个体识别和亲权鉴定中具有较高的应用价值。例如，在进行父系关系检验实践中，有些案例单独依据Y-STR分型结果难以出具明确的鉴定意见[19]，不能仅依据少数几个Y-STR基因座的分型结果不一致而否定父系关系的存在，这种情形下，对高信息量Y-SNP和Y-InDel位点进行分型应是一个可行的补充检验手段。另外，由于Y染色体上66个二等位基因遗传标记的等位基因分布频率与人群地域分布有关系，也可以用于协助判断被鉴定人的居住地或人口迁移信息。

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Sixty-six Biallelic Genetic Markers on Y chromosome by MALDI-TOF-MS

SONG Yu-tong1,2,LI Li1,ZHANG Li-nan1,2,ZHU Ru-xin1,LIU Yan1,LIN Yuan1
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,PRC,Shanghai 200063,China;2.East China University of Political Science and Law,Shanghai 200063,China）

ObjectiveTo analyse the genetic polymorphisms of 66 biallelic genetic markers on Y chromosome in Eastern Chinese Han population,and evaluate their values in forensic application.MethodsGenotyping of 66 biallelic genetic markers on Y chromosome was studied in 205 unrelated males of Eastern Chinese Han population by multiplex PCR combined matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry（MALDI-TOF-MS）.The allele frequencies on the loci to be tested were calculated by direct counting method,and the gene diversity（GD）and haplotype diversity（HD）were calculated by corresponding formulas.The haplotypes of this system were tested by software Arlequin v3.5.2.2 and the comparison of population genetics were analyzed.ResultsA total of 60 biallelic genetic markers on Y chromosome were polymorphic in males of Eastern Chinese Han population,and the ranges of GD were from 0.0385 to 0.5019.Eighty-five different haplotypes were observed and the HD was 0.9703.The differences of partial SNP loci between the Han population of Eastern China and that of Xinjiang and Guangdong were statistically significance.ConclusionSixty biallelic genetic markers and the detection system can complementally provide genetic information in kinship testing and individual identification.The MALDI-TOF-MS technology is able to type biallelic genetic markers.

forensic genetics;Y chromosome;polymorphism,genetic;matrix-assisted laser desorptionionization;single nucleotide polymorphism;insertion/deletion

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.005

1004-5619（2017）03-0239-05

2016-10-28）

（本文编辑：张素华）

“十三五”国家重点研发计划资助项目（2016YFC080 0701）；上海市法医学重点实验室资助项目（17DZ2273200）；上海市司法鉴定专业技术服务平台资助项目（16DZ2290900）；中央级公益性科研院所资助项目（GY2014G-6）

宋雨桐（1992—），女，硕士研究生，主要从事法医物证学研究；E-mail：stystudy＠yeah.net

李莉，女，研究员，硕士研究生导师，主要从事法医物证学科研、检案和教学；E-mail：lil＠ssfjd.cn