CBS在脑挫伤后损伤时间推断中的作用

褚洋，韩国宪，王尧淇，单海燕，陈溪萍，陶陆阳，张明阳

（1．苏州大学医学部法医学系，江苏苏州 215123；2．营口市公安局，辽宁营口 115000；3．黄河中心医院司法鉴定中心，河南郑州 450004；4．苏州市立医院北区妇产科，江苏苏州 215008）

·论著·

CBS在脑挫伤后损伤时间推断中的作用

褚洋1，韩国宪2，王尧淇3，单海燕4，陈溪萍1，陶陆阳1，张明阳1

（1．苏州大学医学部法医学系，江苏苏州 215123；2．营口市公安局，辽宁营口 115000；3．黄河中心医院司法鉴定中心，河南郑州 450004；4．苏州市立医院北区妇产科，江苏苏州 215008）

目的观察胱硫醚β合成酶（cystathionine β-synthase，CBS）在脑挫伤后皮质中不同时段的表达变化。方法利用改良的自由落体装置建立小鼠脑挫伤模型，通过Western印记法和免疫组织化学方法检测不同时间点（1h、6h、12h、1d、2d、3d、7d）损伤区周围皮质CBS的表达变化。结果Western印迹法显示，CBS在脑损伤后皮质中的表达下调，在损伤3d时降到最低，于损伤7d恢复到正常水平。免疫组织化学结果显示，CBS在正常皮质中有表达，损伤后表达逐渐减弱，损伤3d后阳性表达明显减少，7d恢复到正常水平。结论CBS有望成为法医学推断脑挫伤后损伤经过时间的参考指标。

法医病理学；脑损伤；胱硫醚β合成酶；损伤时间；小鼠

胱硫醚β合成酶（cystathionine β-synthase，CBS）是一种磷酸吡哆醛依赖酶，相对分子量63 000，由4个相同的亚基构成同源四聚体。CBS是合成半胱氨酸和胱氨酸的限速酶，通过催化辅酶磷酸吡哆醛和S-腺苷基甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）来调节CBS活性。Northern印迹法分析显示，CBS基因在心、脑、肾、肝等重要器官均有不同程度的表达[1]。同时，CBS也是中枢神经系统内源性硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）合成的限速酶[2]。研究证实，CBS仅在小鼠脑皮质神经元中表达，参与了脑外伤后神经元凋亡的发生发展过程[3，4]。本研究通过建立小鼠脑挫伤模型，观察CBS在小鼠脑挫伤后皮质中的表达变化，探讨其表达在损伤时间推断中的可行性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

兔抗小鼠CBS抗体（sc-67154）、兔抗小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）抗体（sc-25778）购自美国Santa Cruz公司，RIPA裂解液（P0013B）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0009）、增强化学发光（enhanced chemiluminescent，ECL）试剂盒（P0018）均购自上海碧云天生物技术有限公司，生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒（SP-9001）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 脑挫伤模型的建立及分组

雄性CD1小鼠（体质量25～30 g，8周龄，苏州大学实验动物中心提供），腹腔注射10%水合氯醛［生工生物工程（上海）股份有限公司］进行麻醉（剂量为0.1mL/10g），通过改良的自由落体打击法建立小鼠脑挫伤模型[5]。头部剪毛消毒，于头皮正中切开，切口长2cm，剥离右侧颅顶骨膜，固定于小鼠脑立体定位仪上，在左侧顶骨处钻一直径4mm的骨窗［定位坐标：前囟前后（anteroposterior，AP）1.0 mm，中线左右（lateral，LAT）1.0 mm，颅骨（硬脑膜）平面向下（dorsoventral，DEP）2.5mm］，暴露硬脑膜并使其完整。使用40g砝码从20cm高处坠落，撞击于硬脑膜表面上的圆柱体。撞击硬脑膜的圆柱体直径为3 mm，撞击时以圆柱体下降1mm，建立脑挫伤模型，记录打击时间，逐层消毒以预防创口感染，缝合头皮。

实验分为正常对照组，假手术组和伤后1 h、6 h、12h、1 d、2 d、3 d、7 d组，每组6只小鼠。每组小鼠中3只用于Western印迹法，3只用于免疫组织化学染色。假手术组只做开颅手术暴露硬脑膜，正常对照组不做任何处理。

1.3 Western印迹法

提取各组损伤灶周围2mm脑皮质，将取好的大脑皮质层置于250 μL组织裂解液中，超声细胞破碎仪低温匀浆。4℃下，以离心半径8.3cm，14000r/min，离心30min，取上清液，-80℃冰箱保存。取1μL蛋白液，BCA试剂盒测蛋白含量，用细胞裂解液将上样蛋白浓度调成一致。样品按4∶1加入5×十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）上样缓冲液，混匀后沸水变性5 min。30 μg蛋白上样电泳（分别为5%浓缩胶和10%分离胶）2 h后用蛋白湿转装置将蛋白转到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入兔抗CBS（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）多克隆抗体，4℃孵育过夜，洗膜后用Western二抗稀释液稀释过的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗（1∶1000）孵育，37℃放置2h，ECL试剂盒进行胶片显影。胶片扫描，CBS与GAPDH的比值作为CBS的表达程度。

1.4 免疫组织化学染色法

小鼠经腹腔麻醉后，充分暴露心脏，左心室缓慢滴注生理盐水50mL，然后4℃下用4%多聚甲醛50mL进行灌注固定。取各组全脑后放入4%多聚甲醛固定24h，0.01mol/L PBS漂洗后放入含有10%、20%、30%梯度蔗糖中进行脱水。进行冰冻切片，厚度为10μm，取一载玻片将其附贴上即可。制得的冰冻切片储存于-80℃超低温冰箱。免疫组织化学染色按照生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒说明书进行，CBS抗体4℃孵育过夜，以抗体稀释液作为空白对照。

1.5 图像分析与数据分析

采用Gel-Pro Analyzer 4.0软件对Western印迹法检测图像进行采集及光密度分析。每组实验在相同条件下至少重复3次，数据以±s表示，组间比较用单因素方差分析的Tukey检验。

在每张免疫组织化学染色切片中，于损伤侧皮层取5个视野（×400），在HMIAS-2000高清晰度彩色医学图像分析系统下，计算单位面积内阳性细胞个数，取平均值表示各切片的测定结果。用Image-Pro plus 6.0图像分析软件测定5个阳性细胞的光密度，取平均值表示各切片的平均光密度，采用单因素方差分析的Tukey检验进行分析。

所有统计采用SPSS 16.0软件，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Western印迹结果

Western印迹结果表明，CBS在正常脑皮质中有表达。随着损伤时间的延长，CBS的表达在伤后12h开始下调，于伤后3 d降到最低，CBS的表达在伤后第7天又恢复到正常水平（图1，表1）。

图1 脑损伤后CBS在脑皮质中的表达变化

表1 脑损伤后不同时间CBS表达相对表达量（n=3，±s）

表1 脑损伤后不同时间CBS表达相对表达量（n=3，±s）

注：1）与假手术组比较，P<0. 05；2）与正常对照组比较，P<0.05

组别相对表达量正常对照1.389±0.042假手术1.331±0.043伤后1h1.385±0.053伤后6h1.259±0.036伤后12h0.750±0.0451）2）伤后1d0.796±0.0631）2）伤后2d0.765±0.0511）2）伤后3d0.571±0.0481）2）伤后7d1.461±0.059

2.2 免疫组织化学结果

CBS在正常脑皮质中有表达，染色较强且阳性细胞较多。

图2 脑损伤后不同时间CBS免疫组织化学染色结果×200

伤后1h和6h脑皮质阳性细胞数与假手术组差异无统计学意义。伤后12h，阳性细胞数量明显减少，染色强度也明显下降。伤后3d阳性细胞数和染色强度都降到最低，而伤后7d染色明显增强（图2）。阳性细胞数和平均光密度值在正常对照组和假手术组间差异无统计学意义，伤后12 h、1 d、2 d、3 d组与假手术组相比，差异有统计学意义（表2）。

免疫组织化学结果表明，CBS的表达呈先降低后增高趋势，与Western印迹结果显示的趋势一致。

表2 脑损伤后不同时间CBS阳性细胞数和平均光密度（n=3，±s）

表2 脑损伤后不同时间CBS阳性细胞数和平均光密度（n=3，±s）

注：1）与正常对照组比较，P<0. 05；2）与假手术组比较，P<0.05

组别阳性细胞数平均光密度正常对照62.8±1.385.2±13.1假手术63.6±1.284.7±11.7伤后1h60.2±2.082.8±10.6伤后6h58.3±1.883.4±12.7伤后12h32.3±1.41）2）46.1±14.21）2）伤后1d25.4±2.11）2）32.8±13.81）2）伤后2d24.6±1.11）2）35.4±10.21）2）伤后3d15.7±1.61）2）25.4±13.41）2）伤后7d55.9±1.578.4±15.8

3 讨论

创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）在暴力性死亡中占有重要位置，具有高发病率、高死亡率和高致残率等特点[6，7]。而脑挫伤是一种最常见的原发性脑损伤，是指脑实质受力后出血坏死的状况。脑实质包括皮质、白质，但脑挫伤一般以皮质为主[8]。脑挫伤后损伤时间的推断，一直是法医学界研究的重点和难点。运用脑损伤后形态学改变来推断脑损伤时间是比较常见的检测方法。张延波等[9]应用免疫荧光技术发现溶酶体酶Cathepsin-B和D的高表达有助于脑损伤后期的诊断和形成时间推断。但是，脑损伤后形态学的改变需要一定时间才能判断，往往出现得相对较晚，而且各种形态学变化没有明确的时间界限，很难直接进行损伤时间的认定。而寻找一种或者几种特异性蛋白用于脑损伤时间推断或者成伤机制分析，一直是国内外法医病理学者追寻的目标。Chen等[10]发现，人脑挫伤后星形胶质细胞中脑红蛋白的表达可以持续12个月之久。潘泓等[5]发现钙依赖性蛋白激酶Ⅱδ的动态变化，为推断脑外伤后损伤经过时间提供了新的参考指标。王涛等[11]发现血脑屏障相关蛋白闭锁小带蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）在脑外伤后也呈动态变化。这些指标都参与了继发性损伤的病理生理过程，如钙超载会进一步激活钙依赖性蛋白激酶Ⅱδ，缺氧会上调脑红蛋白的表达，ZO-1在维持血脑屏障和诱发脑水肿中起着重要的作用。这些指标的改变可能需经很长时间才能作出判断，而且变化无明确的时间分界并相互重叠。因此，脑损伤时间的推断单靠一个指标是不够的，需要寻求多种与损伤时间相关性较好的指标进行综合分析判断。

CBS是体内同型半胱氨酸转硫途径代谢的关键酶，也是内源性H2S重要的合成酶。H2S被称为第三个气体信号分子，作为神经递质在人体多个系统的病理生理过程中发挥重要作用[12]。CBS基因缺陷可导致转硫途径发生障碍，从而引起半胱氨酸血症，进而导致多种中枢神经系统疾病，如阿尔茨海默病、血管性痴呆、中风等[13-15]。这提示CBS在中枢神经系统中发挥了重要的病理生理作用。之前的研究[3]证实，CBS在小鼠脑外伤后脑皮质神经元中有表达，参与了脑外伤后神经元凋亡的发生发展过程，这提示CBS参与了脑损伤后神经系统的损伤和修复过程。为了确定CBS是否能够用于伤后损伤时间的推断，本研究通过建立小鼠TBI模型检测了不同损伤时间后CBS的表达变化。Western印迹结果显示，损伤后CBS的表达下调，并于伤后3d达到最低值，在伤后7d又恢复到正常水平。免疫组织化学染色结果表明，CBS阳性细胞呈圆形或者锥形，与之前报道[3]的免疫荧光双标结果一致，进一步证实CBS在神经元中表达。而且，在正常脑皮质中CBS呈高强度表达，损伤后表达减弱，并于伤后3d表达明显减弱，7d恢复到正常水平。引起CBS的表达在短时间恢复到正常水平的一个原因很可能是其转录水平受到调控。CBS是一个血红素蛋白，属于磷酸吡哆醛依赖酶中的β族，含有保守的钙调蛋白结合蛋白的共有序列[16]。钙调蛋白抑制剂trifluoroperazine和W-13可以抑制H2S产生，这表明CBS的表达可能由钙和（或）钙调蛋白调节[17]。研究[5，18]证实，脑外伤可以诱导钙依赖性蛋白激酶Ⅱδ的表达，而钙依赖性蛋白激酶Ⅱδ的高表达通过CBS基因的共有序列可以调控其转录水平进而上调CBS的蛋白表达。另外引起CBS损伤3 d后有上调趋势的一个原因可能是氧化应激水平的不断提高。文献[19，20]报道氧化还原应激可以引起CBS mRNA的表达上调。

脑损伤后形态学的变化相对滞后，如果能用Western印迹法检测各种酶、炎症因子、细胞因子及神经递质等蛋白指标的动态变化，对于推断早期脑损伤时间有很大的帮助。CBS的表达呈时序性变化，提示CBS参与了脑损伤后的病理过程。结合形态学的变化，CBS表达的动态变化规律有望成为法医学实际检案中损伤时间推断的指标。同时，脑损伤后CBS的表达差异，对于阐明损伤后发生的分子机制和临床治疗都有一定的帮助。但是CBS的表达并未在人体标本进行验证，实际案例中CBS表达是否也呈时序性变化有待进一步确定。而且，脑损伤程度的轻重对CBS的表达是否有影响也需要进一步通过实验验证。总的来说，单一指标推断脑损伤时间存在一定的局限性，需要结合多种指标和检测手段如形态学、分子生物学、生物化学的方法综合评定。

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The Role of CBS in Injury Time Estimation after Brain Contusion

CHU Yang1,HAN Guo-xian2,WANG Yao-qi3,SHAN Hai-yan4,CHEN Xi-ping1,TAO Lu-yang1,ZHANG Ming-yang1
（1.Department of Forensic Medicine,Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,China;2.Yingkou Public Security Bureau,Yingkou 115000,China;3.Forensic Identification Center of Yellow River Hospital,Zhengzhou 450004,China;4.Department of Obstetrics and Gynecology,North District of Suzhou Municipal Hospital,Suzhou 215008,China）

ObjectiveTo observe the changes of cystathionine β-synthase（CBS）expression in the cerebral cortex after brain contusion at different times.MethodsAn experimental model of traumatic brain injury（TBI）in mice was established by an improved weight-drop device.Then Western blotting and immunohistochemical examination were used to detect the CBS expression in cerebral cortex around injury at different time points（1 h,6 h,12 h,1 d,2 d,3 d,7 d）.ResultsThe results of Western blotting revealed that the expression level of CBS was down-regulated and reached its lowest level at the 3rd days after injury,and then restored to normal level after 7 days.The results of immunohistochemistry showed that CBS was present in the normal brain cortex.CBS expression gradually decreased at the 3rd days after injury,and then restored to normal level after 7 days.ConclusionCBS has the potential to be a reference index for time estimation after brain contusion in forensic practice.

forensic pathology;brain injuries;cystathionine beta-synthase;injury time;mice

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.001

1004-5619（2017）03-0221-04

2015-11-27）

（本文编辑：邹冬华）

国家自然科学基金资助项目（81601306，81301039）；中国博士后科学基金资助项目（2015M570476）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）；上海市法医学重点实验室开放课题资助项目（KF1502）；苏州市科技发展计划资助项目（SYSD2015119）

褚洋（1983—），男，硕士研究生，主要从事颅脑损伤研究；E-mail：44500937@qq.com

张明阳，男，博士，讲师，主要从事法医病理学和法医临床学科研与教学；E-mail：ghost8469@163.com

通信作者：陶陆阳，男，博士,博士研究生导师，主要从事法医病理学和法医临床学科研与教学；E-mail：taoluyang@suda.edu.cn