大鲵皮肤泡制酒抗氧化作用研究

刘旭东，张玉超，杨亮，晏宏，吴纪国，韦圣江，赵雪峰，魏刚，4，*

（1.中国贵州茅台酒厂（集团）有限责任公司茅台学院，贵州仁怀564501；2.贵州省水产技术推广站，贵州贵阳550001；3.正安县畜牧产业发展办公室，贵州遵义563400；4.贵阳学院，贵州贵阳550001）

大鲵皮肤泡制酒抗氧化作用研究

刘旭东1，张玉超1，杨亮1，晏宏2，吴纪国3，韦圣江3，赵雪峰3，魏刚1，4，*

（1.中国贵州茅台酒厂（集团）有限责任公司茅台学院，贵州仁怀564501；2.贵州省水产技术推广站，贵州贵阳550001；3.正安县畜牧产业发展办公室，贵州遵义563400；4.贵阳学院，贵州贵阳550001）

大鲵（Andrias davidianus）是中国珍稀的两栖动物，体内尤其是皮肤含有多种天然活性物质，是制作功能性保健食品的理想材料，将贵州酱香型白酒和大鲵结合研发大鲵保健酒，具有经济和社会效益。对大鲵皮肤泡制酒的抗氧化作用进行研究。结果表明，泡制酒并未引起小鼠肝脏组织病理学改变，且肝脏组织中谷胱甘肽（GSH）的含量、超氧化物歧化酶（SOD）的活性出现了显著性上升（P＜0.05）；活性氧簇（ROS）、丙二醛（MDA）的含量出现了显著性下降（P＜0.05）；8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）和白介素 1β（IL-1β）的含量均未出现显著性变化。结果表明，大鲵皮肤泡制酒具有一定的抗氧化作用，为大鲵保健酒进一步开发增加了可行性。

大鲵；酱香型白酒；大鲵皮肤泡制酒；抗氧化

大鲵（Andrias davidianus）是世界上现存最大的两栖类动物，属于我国Ⅱ级保护动物，也是贵州省生物多样性保护行动计划中的重点保护动物。大鲵体内尤其是皮肤含有多种天然活性物质，包括多种氨基酸以及功能性成分，具有抗菌、抗氧化、抗疲劳等作用[1-4]。现代医学认为，经常食用大鲵可以聪明益智、延缓衰老、提高造血和免疫功能，对预防心脑血管系统疾病、恶性贫血和恶性肿瘤有很好的作用[5-8]，是农业产业化和特色农业重点开发物种，在贵州人工养殖规模不断增加并已形成一定产量，是制作功能性保健产品的理想原材料。

白酒产业是贵州省支柱产业，随着人们生活水平的提高，对于保健酒的关注度也不断增加，但以大鲵为基础开发保健酒还未见报道。将贵州特色的酱香白酒和大鲵有效的结合，不仅具有经济效益，更具有社会效益。该研究以大鲵皮肤和酱香白酒为基础，对大鲵皮肤泡制酒的抗氧化作用进行研究，为大鲵保健酒开发提供理论和数据支持，为开发大鲵保健酒的可行性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用大鲵来自正安县大鲵养殖场。去除大鲵肉和骨，将皮肤组织洗净，切成约1 cm×1 cm的小片。将皮肤组织按照质量体积比1∶10（g/mL）加入53%vol酱香型白酒中，静置泡制30 d，制成10%的泡制酒，实验时使用白酒将10%母液倍比稀释至2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%供使用。

1.2 实验动物

实验动物为SPF级雄性昆明小鼠，体重20 g～22 g，由湖北省实验动物中心提供。小鼠饲养于华中师范大学实验动物中心，饲养环境为每天12 h光照/12 h黑暗，允许自由进食饮水。

1.3 主要试剂盒、试剂与仪器

ROS、MDA、GSH、SOD 检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；8-OHdG检测试剂盒：Kamiya Biomedical Company（加利福尼亚，美国）；TNF-α和IL-1β检测试剂盒：eBioscience Company（加利福尼亚，美国）；其他试剂均为国产分析纯。

5415R低温冷冻离心机：Eppendorf，德国；DNM-9602全波长酶标仪：北京普朗新技术有限公司；FLx 800荧光酶标仪：Bio-Tek，美国。

1.4 实验流程

60只昆明小鼠随机分为6组，分别为：空白对照组、白酒对照组、2.5%泡制酒灌胃组、1.25%泡制酒灌胃组、0.625%泡制酒灌胃组、0.3125%泡制酒灌胃组，以5 mL/（kg·d）[9]的剂量分别对各组小鼠进行连续7 d的生理盐水、53%vol酱香型白酒、2.5%泡制酒、1.25%泡制酒、0.625%泡制酒、0.312 5%泡制酒灌胃，在第8天收集小鼠肝脏组织进行相关指标的测定和组织病理学观察。

1.5 肝组织病理切片制备

第7天灌胃结束24h之后，取小鼠肝组织置于4%的多聚甲醛中固定过夜，随后将组织送至湖北百奥思生物科技有限公司进行固定切片，然后进行H&E染色，并在显微镜下进行观察。

1.6 肝组织匀浆制备

第7天灌胃结束24 h之后，取小鼠肝组织置于匀浆器中，加入PBS（pH=7.5），将组织制成10%的组织匀浆，将组织匀浆于4℃，10 000 r/min离心10 min，收集上清液进行相关指标的测定，蛋白质含量采用福林酚法测定[10]。

1.7 生化指标的测定

取肝组织匀浆上清液，按照相关试剂盒说明书步骤，进行 ROS、MDA、GSH、SOD、8-OHdG、TNF-α 和IL-1β的测定。

1.8 统计分析

实验数据采用SPSS进行单因素方差（ANOVA）分析，使用LSD检验比较两组数据间的差异性，统计检验水准P＜0.05为差异有统计学意义，采用Origin 6.1统计分析软件进行制图。

2 结果与分析

2.1 肝脏组织病理学观察

肝脏组织切片H&E染色结果显示见图1。

图1 小鼠肝脏组织病理学观察（H&E染色）Fig.1 Histological images of liver slices（stained with H&E）

图1显示空白对照组（a）、泡制酒组以（c-f）的肝脏组织细胞正常，肝索肝窦比例正常，而白酒组（b）肝窦轻度变窄，提示肝细胞可能出现了轻度水肿。

2.2 小鼠体重增长变化

表1显示了连续灌胃7 d后各组小鼠体重增长量的情况。

由表1可知，7 d的连续灌胃后各组小鼠的体重均出现了增长。空白对照组的体重增长量最大，其他各组的增长量和空白对照组比出现了显著性的下降，但1.25%泡制酒组小鼠体重增长量和白酒组相比有显著性的上升。

2.3 肝脏组织中ROS水平测定

连续灌胃7 d后，小鼠肝脏组织中ROS的含量（以相对荧光量表示）如图2所示。

表1 小鼠体重增长量的情况Table 1 The bodyweight increased of mice

图2 小鼠肝脏组织中ROS相对荧光强度Fig.2 The ROS relative fluorescence of mice live

图2结果显示，连续灌胃7 d后白酒组小鼠肝脏组织中ROS含量和空白组相比出现了显著性的上升；2.5%、1.25%、0.625%泡制酒组ROS的含量和白酒组及空白组相比均出现了显著性的下降。

2.4 肝脏组织中MDA含量的测定

连续灌胃7 d后，小鼠肝脏组织中MDA的含量如图3所示。

从图3可以看出，连续灌胃7 d后，白酒组小鼠肝脏组织中MDA含量与空白对照组相比出现了显著性的上升；0.625%小鼠肝脏组织中MDA含量与白酒组相比出现了显著性的下降；而1.25%泡制酒组MDA的含量和白酒组及空白组相比均出现了极显著性的下降。

2.5 肝脏组织中GSH含量测定

图4显示了连续灌胃7 d后各组小鼠肝脏组织中GSH的含量。

图4结果显示除白酒组和0.312 5%组外，0.625%组、1.25%组、2.5%组和白酒组及空白组相比肝脏组织中GSH的含量均出现了显著性的上升。

2.6 肝脏组织中SOD活性的测定

图5显示7 d连续灌胃结束后小鼠肝脏组织中SOD的活性变化。

结果显示1.25%组肝脏组织中SOD活性和白酒组及空白组相比均出现了极显著性上升。

2.7 肝脏组织中TNF-α含量的测定

图6显示灌胃后各组小鼠肝脏组织内TNF-α含量。

图3 小鼠肝脏组织中MDA含量Fig.3 The concentration of MDA in mice live

图4 小鼠肝脏组织中GSH含量Fig.4 The concentration of GSH in mice live

图5 小鼠肝脏组织中SOD活性Fig.5 The SOD activities in mice live

图6 小鼠肝脏组织中TNF-α含量Fig.6 The concentration of TNF-α in mice live

结果显示各组小鼠肝组织中TNF-α含量无显著性差异。

2.8 肝脏组织中IL-1β含量的测定

图7显示灌胃后各组小鼠肝脏组织内IL-1β含量。

图7 小鼠肝脏组织中IL-1β含量Fig.7 The concentration of IL-1β in mice live

结果显示各组小鼠肝组织中IL-1β含量无显著性差异。

2.9 肝脏组织中8-OHdG含量的测定

图8显示灌胃后各组小鼠肝脏组织内8-OHdG含量。

图8 小鼠肝脏8-OHdG含量Fig.8 The concentration of 8-OHdG in mice live

结果显示各组小鼠肝组织中8-OHdG含量无显著性差异。

3 结论与讨论

大鲵在贵州省的人工养殖已形成一定规模，是制作功能性保健品的理想原材料。该研究将大鲵与贵州特色酱香白酒结合，对大鲵皮肤泡制酒的抗氧化作用进行研究。机体代谢会产生大量的活性氧基团，正常生理条件下，机体内的氧化和抗氧化系统处于一个动态平衡的状态以保护机体不受到活性氧基团的损伤，当平衡被打破，大量活性氧基团积累，机体出现氧化应激。过量的活性氧基团可以损伤体内生物大分子如：蛋白质、脂质、DNA 等[11-13]。

实验结果显示，小鼠连续一周进行白酒灌胃后肝脏组织中活性氧簇ROS的含量和空白对照组相比显著性升高，而0.625%、1.25%、2.5%大鲵皮肤泡制酒组和空白对照组及白酒组相比ROS含量均出现了显著性的下降。丙二醛MDA是脂质过氧化的重要产物[14]，经过7 d连续灌胃，白酒组小鼠出现了肝脏组织的脂质过氧化，MDA含量显著性的上升，但0.625%泡制酒组和白酒组相比出现了显著性的下降，1.25%泡制酒组和空白对照组及白酒组相比MDA含量均出现了显著性的下降。以上实验结果表明，连续一周饮用白酒后，小鼠肝脏组织出现了氧化损伤，而大鲵皮肤泡制酒体能够降低ROS和MDA的含量，体现出了一定的解毒作用（和白酒组相比具有阳性结果）及保健作用（和空白对照组相比有阳性结果）。

谷胱甘肽GSH是机体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂[15]，0.625%、1.25%、2.5%大鲵泡制酒均可引起肝组织内GSH的显著性升高。超氧化物歧化酶SOD是生物体内重要的抗氧化酶，广泛地存在于各种生物体[16]，1.25%泡制酒可以显著的提高肝脏组织内SOD的活性。以上结果显示，大鲵泡制酒可以通过提高GSH含量以及SOD活性来进行抗氧化的作用，降低连续饮酒引起的氧化应激，以此来提高机体的抗氧化能力。

按照目前已有的氧化应激分级模型假说[17]，根据氧化应激水平的强弱以及对生物体造成损伤的严重程度，氧化应激可以分为多个层次。最低水平的氧化应激，可以引起细胞的自我保护作用，细胞使用自身的抗氧化酶和还原性物质来清除过量的ROS。随着氧化应激水平的提高，高水平的氧化应激将会导致炎症反应的产生，增加炎症因子，例如：TNF-α和IL-1β的表达量。该研究表明连续饮用白酒和泡制酒一周均未引起肝脏组织炎症反应，连续饮用白酒虽引起肝脏组织氧化应激，但是并未引起组织炎症反应。长期连续饮用白酒是否能够引发肝脏组织炎症反应，而泡制酒是否具有抗炎作用则需要后期进一步研究。

8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）是活性氧自由基攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基第8位碳原子而产生的一种氧化性加合物，目前是DNA氧化损伤中最常用的生物标志物[18]。连续饮用白酒会导致肝脏组织中活性氧含量升高，大量的活性氧可能会导致肝脏组织DNA损伤。通过本实验，结果表明连续饮用一周白酒和泡制酒均未引起肝脏组织的DNA氧化损伤。

综合以上实验结果，酱香型白酒可以引起小鼠肝脏组织氧化损伤，ROS含量上升，脂质出现过氧化。将大鲵皮肤在酱香型白酒中浸泡一段时间（本研究为30 d），制成大鲵皮肤泡制酒在0.625%和1.25%浓度不但可以显著性的降低白酒引起的氧化应激作用（和白酒组对比），同时也可以显著性降低机体氧化水平（和空白对照组比），体现出了大鲵皮肤泡制酒具有一定解毒和保健作用。该研究为有效结合中国特色的大鲵和贵州酱香白酒而开发出大鲵保健酒的可行性提供依据。后期将进一步优化泡制酒工艺，对其抗炎、抗疲劳、抗菌、抗病等方面的作用进行研究。

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The Research on the Antioxidation of Andrias davidianus Skin Brewed Spirit

LIU Xu-dong1，ZHANG Yu-chao1，YANG Liang1，YAN Hong2，WU Ji-guo3，WEI Sheng-jiang3，ZHAO Xue-feng3，WEI Gang1，4，*
（1.Moutai University of Moutai Distillery（Group）Co.Ltd.，Renhuai 564501，Guizhou，China；2.Aquatic Product Technical Advice Station of Guizhou Province，Guiyang 550001，Guizhou，China；3.Developing Office of Animal Hansbadry of Zheng'an，Zunyi 563400，Guizhou，China；4.Guiyang University，Guiyang 550001，Guizhou，China）

Andrias davidianus is a precious kind of amphibian in China.Its body especially its skins are rich in various nature active products.So it is the ideal material for making functional health care products，combine Guizhou Maotai-flavour spirit with Andrias davidianus has great economic and social benefits.The study aimed at doing a primary research on the antioxidation of Andrias davidianus skin brewed spirit.The result showed that for the mouse of the gavage brewed spirit group，there was no pathological alteration on liver tissue while in which the content of GSH and the activity of SOD rose significantly.The contents of ROS and MDA showed significant decrease；the contents of 8-OHdG，TNF-α，IL-1β showed no significant variation.The results indicated that Andrias davidianus skin brewed spirit had antioxidation to a certain extent，so as to increase the feasibility of further development of Andrias davidianus health care spirit.

Andrias davidianus；Maotai-flavour spirit；Andrias davidianus skin brewed spirit；antioxidation

2016-09-01

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.041

国家自然科学基金项目（No.31360144）；2015年大鲵产业发展专项资金（黔财农[2015]198号）

刘旭东（1989—），男（汉），硕士，主要从事环境及食品毒理学研究。

*通信作者：魏刚（1954—），男（汉），教授，博士，主要从事两栖动物保护与利用研究。