北冬虫夏草副产物功能因子提取工艺研究

张斌，刘博华，温禄云

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

北冬虫夏草副产物功能因子提取工艺研究

张斌，刘博华，温禄云

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

北冬虫夏草副产物为成熟子实体采摘后的培养基残基、菌丝体残体，主要活性成分与子实体相近，为虫草多糖、虫草酸、虫草素、腺苷类及蛋白质等。采用双频超声波辅助提取技术、酶工程技术，对北冬虫夏草副产物中的虫草多糖、虫草素、虫草酸、多肽等功能因子进行提取。干燥提取物中多糖含量25.4%、虫草素含量0.6%、虫草酸含量5.2%、多肽含量23.7%。

北冬虫夏草副产物；双频超声波；酶工程

北冬虫夏草又名北冬虫夏草、北虫草、虫草花，拉丁学名为Cordycepsmilitaris，野生北冬虫夏草是一种寄生于鳞翅目和鞘翅目昆虫蛹提上的大型真菌，与传统中药材冬虫夏草（Cordycepssinensis）同属于子囊菌亚门，麦角菌目，虫草菌属[1]。北冬虫草天然资源的世界性分布数量很少，由子座（草的部分）、核菌（虫的尸体部分）组成，多以蛾蛹或蚕蛹为寄主[2]。既是一种珍稀的食用菌，又是一种珍贵的中药材。2009年，经中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会批准，北冬虫夏草可以作为新资源食品，可直接食用，也可作为食品原料，在酒类、罐头、调味品、饮料中应用[3]，这为北冬虫夏草资源的开发和利用起到了十分积极的作用。

1986年吉林省蚕业通过在家蚕和昨蚕上培养北虫草成功获得子实体[4]。90年代后，以大米培养基为主的固态培养基栽培法逐渐普及，这也是目前北冬虫夏草最主要的人工培养方式。收获北冬虫夏草子实体后，培养基残基通常被作为废弃物处理，据统计可知栽培时北虫草子实体干重与虫草基干重之比为1∶3或1∶4，废弃培养基势必造成资源的极大浪费，堆积后发酸发臭对环境也产生一定的影响。随着北虫草栽培产业规模的不断扩大，对北虫草固体培养残基如何进行产品加工开发、对活性成分的提取利用己成为迫切需要解决的问题。培养基残基中仍含有部分虫草子实体和大量菌丝体，目前己有利用北虫草培养基残基酿制功能型醋[5]、功能型保健酱油[6]等报道，但总体来说，剩余基质的利用率仍然较低。

经检测，北虫草培养基残基中的营养成分与功能因子种类与子实体一致，均含有大量的蛋白质、氨基酸、虫草酸、虫草素、虫草多糖等[7]（见表1），虽含量较低，但其数量巨大，价格低廉，来源丰富，因此从剩余基质中提取营养物质和功能因子，具有一定的研究价值。

表1 北冬虫夏草副产物中主要营养物质的含量对比Table 1 The content of main nutrients of Cordycepsmilitaris by-products

1 材料与方法

1.1 材料

人工培养北冬虫夏草采收后的培养基残基：天津东方中滨农业科技有限公司；中性蛋白酶（2×106U/g）、无水乙醇（均为食品级）：北方霞光食品添加剂有限公司；氢氧化钠、硫酸铝、苯酚、浓硫酸、3，5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、L-鼠李糖、乙腈（均为分析纯）：天津赢达稀贵化学试剂厂；虫草素标品（色谱纯）：国家标准物质中心。

1.2 主要仪器设备

酶解罐、双频超声波发生器：天津市食品研究所有限公司自制；DZ-1AI电热烘干箱、全波长紫外分光光度计、凯氏定氮仪：天津市泰斯特仪器有限公司；YLS-16A快速水分测定仪：上海精密科学仪器有限公司；LC-100高效液相色谱仪：日本岛津公司；DGT-ZF-3双效蒸发器：天津德固特科技有限公司；离心式喷雾干燥器：常州力马干燥设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

培养基残基→分选→破碎→双频超声波辅助提取、酶解→灭酶→过滤→浓缩→喷雾干燥

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 分选

去除在运输及贮藏过程中发生霉变或被污染的培养基。

1.3.2.2 破碎

加入培养基干基重量5倍～10倍的水，使用高剪切破碎机进行打浆破碎。破碎后的物料无明显颗粒（≥0.2 cm3）。

1.3.2.3 双频超声波辅助提取及酶解

将破碎的料浆置于加装25 kHz和40 kHz双频超声波装置的提取罐，调节pH值至7.0～7.5，升温至40℃～60℃，加入一定量中性蛋白酶，开启搅拌，选择超声波功率200 W～400 W，处理20 min～60 min后，关闭超声，继续酶解2 h～5 h。

1.3.2.4 灭酶

将物料升温至85℃，保持20 min，灭酶、杀菌。

1.3.2.5 过滤

酶解后的料液使用40目滤布进行粗滤，滤液使用80目板框过滤机进行过滤。

1.3.2.6 浓缩

滤液使用双效蒸发器浓缩至可溶性固形物≥25%。

1.3.2.7 喷雾干燥

使用离心式喷雾干燥器进行喷雾干燥，进风温度150℃，出风温度80℃，喷雾干燥后的粉末水分含量≤5%。取样进行多糖、粗蛋白含量、多肽含量（5000Da～10 000 Da）、游离氨基酸含量、虫草酸、虫草素的测定。

1.3.3 超声波辅助工艺提取正交分析

根据丘泰球、曾荣华等[8-10]的研究结果25 kHz与40 kHz的双频超声波对于植物中功效成分的提取效果最佳，因此本研究采用超声频率为25 kHz与40 kHz双频超声波进行辅助提取，以料液比1∶8（g/mL），超声功率300 W、处理40 min、温度55℃，pH7.0为基础条件，进行料液比=1∶5、1 ∶6、1 ∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g/mL），超声波功率 200、250、300、350、400 W，处理 20、30、40、50、60、70、80、90 min，处理温度 45、50、55、60、65 ℃等单因素的水平试验。处理后直接取料液，6 000 r/min离心10 min后，取上清液，进行多糖检测，通过与预先检测的未提取前物料的多糖含量计算提取率，确定各因素最佳条件为料液比、超声波功率、处理温度、处理时间在各自因素水平上的最佳条件为：1∶8（g/mL）、300 W、50 min、60 ℃。

据此设计L9（34）正交试验，因素包括：料液比、超声波功率、处理温度、处理时间，因素水平表见表2。

表2 双频超声波辅助提取优化条件试验因素和水平Table 2 Dual-frequency ultrasound assisted extraction optimization condition test factors and levels

1.3.4 酶解工艺正交分析

采用的中性蛋白酶活力为2×105U/g，建议使用量为0.2%～0.8%，pH值为6～8，酶解温度45℃～65℃。在最佳双频超声波辅助提取条件下，以中性蛋白酶0.5%、（以物料干基重计），pH7.0，酶解温度50℃、酶解4 h为基础条件，进行中性蛋白酶添加量0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%，pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，酶解时间 2、3、4、5、6、7 h，酶解温度 40、45、50、55、60、65℃单因素的水平试验。处理后直接取料液，6 000 r/min离心10 min后，取上清液，进行总氮及氨基酸态氮的检测，通过计算水解度，确定各因素最佳条件为中性蛋白酶添加量、pH值、值酶解温度、酶解时间为在各自因素水平上的最佳条件为：0.5%、7.0、55℃、4 h。

据此设计L9（34）正交试验，因素包括：中性蛋白酶添加量、pH值、酶解时间、酶解温度，因素水平表见表3。

表3 酶解工艺条件试验因素和水平Table 3 Enzyme hydrolysis condition test factors and levels

2 结果与讨论

2.1北冬虫夏草副产物超声波辅助提取工艺条件研究

北冬虫夏草副产物超声波辅助提取正交试验结果见表4。

由正交试验可知，所选各因素在试验范围内对北冬虫夏草副产物功能因子的提取效果有不同的影响，各因素对提取率影响的顺序为D＞B＞C＞A，最佳的提取条件为A2B2C2D3。即料液比为1∶8（g/mL），超声波功率300 W，处理时间50 min，处理温度65℃。在此条件下进行验证试验，提取率为91.7%，多糖提取效果优于正交试验结果。

表4 北冬虫夏草副产物超声波辅助提取正交试验结果Table 4 C.militaris by-product of ultrasonic assisted extraction of orthogonal test results

2.2 酶解工艺条件研究

酶解工艺条件研究正交试验见表5。

表5 北冬虫夏草副产物超声波酶解正交试验结果Table 5 The results of orthogonal test of C.militaris by-product ultrasonic enzyme

由表5可知，所选各因素在试验范围内对北冬虫夏草副产物中蛋白质的酶解效果有不同的影响，各因素对水解度影响的顺序为A＞B＞C＞D，最佳的酶解条件为A3B3C3D2，即中性蛋白酶添加量0.6%、pH7.5、酶解时间为5 h、酶解温度为55℃。在此条件下进行验证试验，水解度为35.7%，优于正交试验结果。

2.3 北冬虫夏草副产物提取物营养成分及功能因子分析

取3个批次喷雾干燥后的提取物粉末进行多糖、粗蛋白、多肽、虫草酸、虫草素含量的测定。测定结果见表6。

表6 北冬虫夏草副产物提取物功能因子含量Table 6 C.militaris by-product Extract function factor content%

由表6可知，北冬虫夏草副产物提取物多糖含量少于北冬虫夏草子实体，粗蛋白含量、多肽含量、虫草酸、虫草素均明显高于干燥子实体。经酶解处理后的副产物提取物多肽含量是未经酶解处理子实体的近10倍，虫草酸含量超过子实体含量近50%，虫草素含量超过子实体含量1倍。通过将北冬虫夏草培养基残基进行提取与酶解，不仅将废物综合利用，同时营养价值大幅提升。

3 结论

通过研究，北冬虫夏草副产物功能因子提取的最佳工艺为将采收后的北冬虫夏草培养基残基按干物质重量加入8倍净化水，使用高剪切破碎机破碎，使用10目筛网过滤后加入至安装25 kHz和40 kHz双频超声波发生装置的提取罐内进行提取，首先开启搅拌，调节pH值至7.5，之后将物料升温至65℃，加入干基重0.6%的中性蛋白酶，开启超声波发生装置进行辅助提取。超声波功率300 W，开启50 min，处理温度65℃。超声波辅助提取结束后，将温度降至55℃继续进行酶解，酶解310 min后，将料液升温至85℃并保温20 min灭酶、杀菌。经检测多糖提取率为91.7%，水解度为35.7%，干燥提取物中多糖含量为22.0%、粗蛋白含量45.6%、多肽含量23.7%、虫草酸含量5.2%、虫草素含量0.6%。

[1] 邵力平.真菌分类学[M].北京:中国林业出版社,1984:11091

[2] 张显科,王玉柱,刘文霞,等.北冬虫夏草与冬虫夏草化学成分比较[J].辽宁大学学报(自然科学版),1996,23(4):79-82

[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.卫生部关于批准蛹虫草为新资源食品的公告(2009年第3号)[EB/OL].(2009-03-18).http://www.nhfpc.gov.cn/zwgkzt/wsbysj/200903/39591.shtml

[4] 古恒生,梁漫逸．人工培育北冬虫夏草研究[J]．药学情报通讯,1987,5(3):51

[5] 曾洪斌,李泰辉,钟月金,等.北冬虫夏草营养保健醋的研制[J].食品科学,2009,30(2):289-291

[6] 岳春姬,鄂豫,黄达伟,等.利用北冬虫夏草培养基生产保健酱油的研究[J].中国调味品,2007(3):24-37

[7] 范卫强,尹鸿萍,周长林.虫草多糖的分离、纯化和初步药效活性研究[J].生物加工过程,2008,6(1):69-73

[8] 丘泰球,曾荣华,张晓燕．双频超声强化提取的机理[J]．华南理工大学学报(自然科学版),2006,34(8):89-93

[9] 曾荣华,丘泰球．双频超声空化效应强化提取中药有效成分的实验研究[J]．声学技术,2005,24(4):219-222

[10]贲永光,丘泰球,曾荣华.双频超声强化从海金沙中提取黄丽的实验研究[J].声学技术,2006,25(3):209-213

The Research of Cordycepsmilitaris By-products Function Factor Extraction Process

ZHANG Bin，LIU Bo-hua，WEN Lu-yun
（Tianjin Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）

Cordycepsmilitaris by-products is medium after picked fruit bodyand mycelium.Main active ingredient is similar to fruiting body including Cordycepsmilitaris polysaccharide，cordyceps acid，cordycepin，adenosine，protein，etc.The research adopts the dual-frequency ultrasound assisted extraction technology，enzyme engineering technology，extract of Cordycepsmilitaris polysaccharide，cordycepin，cordyceps acid，polypeptide，from C.militaris by-products.In the dry extract，polysaccharide content was 25.4%，cordycepin content was 0.6%，cordyceps acid content was 5.2%，polypeptide content was 23.7%.

Cordycepsmilitaris by-products；dual-frequency ultrasound；enzyme engineering technology

2017-03-31

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.013

天津市科技计划项目（16YFFCZ00170）

张斌（1984—），男（汉），工程师，硕士，研究方向：保健、功能食品加工技术。