免疫组化与原位杂交双标记技术检测EB病毒用于诊断鼻咽癌

罗俭权 曾秀英 吕镜雄 陈春梅 程思锐 冯天斌

免疫组化与原位杂交双标记技术检测EB病毒用于诊断鼻咽癌

罗俭权 曾秀英 吕镜雄 陈春梅 程思锐 冯天斌

目的 探析鼻咽癌诊断中检测EB病毒更为快速及更灵敏的方法。方法 选择2014年4月至2016年8月广东省四会市人民医院收治的36例鼻咽癌患者，分别采用EB病毒一抗、地高辛标记的寡核苷酸EBER探针进行免疫组化和原位杂交双重标记染色，检测鼻咽癌细胞中EB病毒的表达情况。结果 免疫组化后的阳性细胞的胞膜表现为红色，原位杂交后的阳性细胞胞核表现为蓝黑色，而双阳性细胞的核与膜呈蓝红色，不仅对比鲜明而且背景非常清晰，双染成功后细胞及组织结构表现完整。结论 EBER原位杂交双标记技术检测EB病毒主要是检测病毒基因，具有极高的特异性和灵敏度，比免疫组化方法更灵敏、快速，可以帮助临床进行鼻咽癌的分期诊断及判断治疗效果。

鼻咽癌； 病理诊断； 双标记原位杂交； 免疫组化

鼻咽癌是一种在我国南方地区（如广州等）发病率非常高的恶性肿瘤，占鼻咽部恶性肿瘤的97%［1］。鼻咽癌的治疗除手术外，中医药治疗对于提高患者的生存率有很好的作用［2］。鼻咽癌又分为鳞状细胞癌和非角化鳞癌；非角化鳞癌又分为混合型癌、圆形细胞癌（未分化型癌）及梭形细胞癌（分化型非角化鳞癌）［3-4］。我国南方地区发生的鼻咽癌95%属于非角化鳞癌。

鼻咽癌确诊前需活检病理诊断，应用较多的指标是细胞角蛋白（CK）免疫组化染色。研究发现，EB病毒感染与鼻咽癌尤其非角化型鼻咽癌密切相关［5-6］，对于组织切片上检测EB病毒对鼻咽癌的诊断具有重要意义。在一张切片中行免疫组化细胞角蛋白染色与EB病毒编码的小RNA（EBER）原位杂交，双标记方法进行套染，可同时分析两种指标在鼻咽癌细胞中的表达情况。结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤则属于一种侵袭性结外淋巴瘤，形态特殊，预后差，其与EB病毒感染亦密切相关。免疫组化是传统的检测方法，但这种方法不易检测到低拷贝数RNA或DNA在细胞内的存在［6-7］。

本研究通过分析我院收治的36例鼻咽癌患者临床资料，比较免疫组化与原位杂交双重标记技术两种方法在鼻咽癌诊断中的检测结果，现总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究选用的全部标本均取自我院2014年4月至2016年8月收治的36例鼻咽癌患者，且经病理学诊断。病检组织切片厚3～4 μm，用中性甲醛固定，常规石蜡包埋。实验所用全部试剂均由北京金桥生物技术有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化具体步骤 将显色后呈阳性的切片脱蜡、蒸馏水洗涤，用pH 6.0的0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液（95～100 ℃）微波修复抗原15 min，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，然后用10%羊血清封闭孵育10 min，EB病毒单克隆抗体（单抗）工作液4 ℃过夜后PBS冲洗；37 ℃室温孵育30 min，二氨基联苯胺（DAB）显色，显微镜下仔细观察显色情况，脱水、透明、水溶性封片剂封固。

1.2.2 原位杂交双标记具体步骤 将3～4 μm厚的切片常规脱蜡至水，滴加100 μL蛋白酶K液，放置于60 ℃烤箱烘烤30 min，蒸馏水洗涤后无水乙醇脱水，空气干燥。切片组织上滴加20 μL EBER探针杂交液，加上经灭酶处理的洁净盖玻片，放入湿盒中37 ℃下孵育3 h；取出切片，Tris缓冲盐溶液（TBS）冲洗3 min；滴加100 μL封闭液，室温孵育 10 min；甩干，加入生物素标记的羊抗鼠单抗标记物室温孵育30 min；TBS冲洗5 min，加入5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/四唑硝基蓝（BCIP/NBT）显色液，苏木精复染，脱水、透明、封固。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果 送检鼻咽黏膜表面被覆假复层纤毛柱状上皮，固有层内淋巴组织增生，间质疏松水肿，伴淋巴细胞、浆细胞和嗜酸粒细胞浸润，部分细胞明显异型。免疫组化结果显示：CK（+）、P63（+）、T淋巴细胞CD3（+）、B淋巴细胞CD20（+）、CD56（-）、GrB（灶状+）、Ki67（+，20%）。见图1。

图1 鼻咽癌免疫组化CK阳性结果

2.2 原位杂交结果 双染成功后细胞及组织结构表现完整；采用免疫组化检测结果显示，CK定位于细胞浆内，阳性细胞的胞膜呈现红色；采用原位杂交检测结果显示，EBER阳性反应则定位于鼻咽癌细胞的细胞核上，阳性细胞的胞核呈现蓝黑色，而双阳性细胞的核与膜呈蓝红，不仅背景非常清晰，而且对比鲜明。

图2 原位杂交EBER检测结果

3 讨论

EB病毒感染较多的部位是人类口咽部的B淋巴细胞与上皮细胞［8］。EB病毒不仅可以感染B淋巴细胞，还可以转化B淋巴细胞，目前已发现的EB病毒潜伏基因表达有10余种。EBER原位杂交技术是在组织切片上检测EB病毒敏感而有效的手段，取同一鼻咽癌组织切片，采用原位杂交与免疫组化双重标记技术检测CK和EB病毒，这为观察阳性细胞是否也存在EB病毒感染提供了重要依据［9-10］。

相对EBER原位杂交技术而言，CK染色则是鼻咽癌诊断中应用广泛的一个免疫组化指标。但这种方法在临床诊断鼻咽癌病理中应注意与淋巴瘤、鼻咽肉瘤进行区别，淋巴瘤细胞和肉瘤细胞的CK染色表现为阴性时，鼻咽癌细胞CK则表现为阳性［11］。鼻咽上皮性病变的细胞偶尔也呈现CK阳性，极易误诊为鼻咽癌，但经EB病毒检测则呈阴性，据此可与鼻咽癌区分开。广州等南方城市95%以上的鼻咽癌是非角化性癌，鼻咽非角化性癌中特别是鼻咽型未分化癌多是EB病毒感染所致，因而可以说，检测组织切片EB病毒有助于鼻咽癌的病理诊断［12-13］。原位杂交技术、免疫组化染色应用的显色剂有多种多样，选择不同的显色剂，其获得的颜色和阳性结果均不同［14］。本研究的免疫组化结果显示：CK（+）、P63（+）、T淋巴细胞CD3（+）、B淋巴细胞CD20（+）、CD56（-）、GrB（灶状+）、Ki67（+，20%），与上述研究文献报道一致。

双重标记中选用的显色剂恰当，可清晰对比两种染色结果，从而便于临床的观察诊断。由于原位杂交技术和免疫组化两种方法原理不同，检测结果亦不相同。免疫组化检测的是用EB病毒编码的LMP-1膜蛋白，不仅价格便宜、检测灵敏度高，而且操作方便、步骤简单，但是无法检出EB病毒的定位及转录数量，因此往往作为EB病毒的初筛手段［15］。原位杂交检测中采用的EBER-1探针，能够探查到经甲醛固定、石蜡包埋的鼻咽癌标本，在肿瘤细胞原位即可检测是否存在EB病毒，不仅定位准确，而且特异性强。此外，有时由于鼻咽癌组织中有效结合点减少、核酸的变性、弥散，加上组织固定又欠佳，故染色可能会呈阳性标记弱，有时甚至假阴性。本研究中作者尝试用EBER原位杂交检测以及CK免疫组化检测，AEC显色、DAB显色，EBER原位杂交染色结果表现为棕色，无弥散，也未褪色，但红色与棕色对比效果不佳，红色的CK不易观察。

临床检测工作中，影响原位杂交双重标记技术和免疫组化的因素较多，要想取得最佳染色结果，作者有以下几点体会： ① 由于CK的孵育时间比平时的要短些，因而显色最好在镜下控制，防止由于显色过深，影响与EBER染色结果的对比。② 用EBER进行杂交时需防止探针被RNA酶降解，操作时除严格遵循戴口罩、手套原则外，各项实验设备还必须经过200 ℃烤箱过夜或焦碳酸二乙酯（DEPC）水充分浸泡。原位杂交显色过程在4 ℃冰箱中进行（过夜），可使显色的过程减慢，从而减少了背景着色，充分进行冲洗又利于减轻背景的非特异性染色。③ 原位杂交技术检测完成后需进行抗原修复，选择再放入pH 8.0的Tris/EDTA缓冲液进行中、高压修复比应用pH 6.0柠檬酸缓冲液或不修复效果都要更好。EBER阳性定位在细胞核，不需要复染苏木素，以免遮盖EBER的阳性表达。如果必须染色可淡染核固红，此时细胞核表现为红色。④ 中性树脂中含有的二甲苯会导致EBER阳性颗粒弥散，从而使检测结果的准确性受到影响，因而选择水溶性封片剂封固切片较佳。封片后还应尽早采集图片，进行保存，防止显色时间过长导致褪色。

综上所述，EB病毒与鼻咽癌的发生密切相关，在鼻咽癌病理诊断工作中，EBER原位杂交双标记技术优于传统的免疫组化技术。

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（本文编辑：李银平）

Detection value of serum retinol binding protein in diagnosis and treatment stage of diabetics with urinary tract infection

Luo Jianquan, Zeng Xiuying, Lyu Jingxiong, Chen Chunmei, Cheng Sirui, Feng Tianbin. The People's Hospital of Sihui City, Zhaoqing 526200, Guangdong, China

Corresponding author: Luo Jianquan, Email: luo3335686@163.com

Objective Investigation on a more rapid and sensitive EB virus detecting method in the diagnosis of nasopharynx cancer. Methods 36 patients with nasopharynx cancer admitted in the People's Hospital of Sihui City, Guangdong Province from April 2014 to August 2016 were selected as objects. Double labeling staining respectively were immunohistochemistry and in situ hybridization were conducted using oligonucleotides EBER probe tagged with the primary antibodies of EB virus and digoxin to detect the expression of EB virus in the nasopharynx cancer cells. Results The positive cells' membrane of immunohistochemistry was red. The positive cells' nucleus of in situ hybridization was black blue. The double positive cells' nucleus and membrane were blue red, the color contrast of which was very obvious in a very clear background. The cell and tissue structure were intact after the double labeling staining. Conclusions The technology of EBER in situ hybridization with double tags is mainly applied in the detection of virus gene and has super specificity and sensitivity. It is more sensitive and rapid than the immunohistochemistry and could contribute to the staging diagnosis and therapeutic effect determination clinically.

Nasopharyngeal carcinoma; pathological diagnosis; double labeled in situ hybridization; immunohistochemistry

广东省肇庆市科技创新计划项目（2016040301）

526200 广东肇庆，广东省四会市人民医院

罗俭权，Email：luo3335686@163.com

10.3969/j.issn.1674-7151.2017.02.005

2017-03-09）