污灌农田土壤中微生物群落碳源代谢及功能多样性的研究

林立，王涵

（武夷学院生态与资源工程学院，福建武夷山354300）

污灌农田土壤中微生物群落碳源代谢及功能多样性的研究

林立，王涵

（武夷学院生态与资源工程学院，福建武夷山354300）

为研究污灌农田土壤中微生物代谢和功能多样性，调查了冶炼厂附近农田土壤营养元素含量、重金属含量并通过生态板法（AWCD）和Shannon-Wiener指数、Simpson指数测定其微生物代谢特性和功能多样性。结果显示，农田土壤受Cu、Cd、Pb、Zn轻度或中度污染。Cd、Zn和速效P是影响土壤微生物代谢多样性的主要因素，重金属刺激微生物代谢，速效P降低生物代谢。Cd可增加土壤微生物群落的功能多样性；含量过高的营养元素（如速效P）会降低土壤微生物多样性。

重金属污染；微生物代谢特性；微生物功能多样性；农田土壤

土壤重金属污染现象，已经成为现代土壤生态环境保护的一个突出问题[1]。随着工农业的发展，大量含有重金属的废水、废渣通过各种途径污染农田。农田重金属污染不仅造成作物产量与品质下降，还可通过农作物的富集作用影响人类健康，而且重金属长期污染也可能影响农田土壤的理化性质[2]。KANDELER等[3]认为，通过对土壤微生物特性和土壤酶活性的监测能够了解土壤受外界干扰的状况。而JONER等[4]通过田间添加Al的原位实验后得出结论，比较植物根系和土壤化学性质，土壤微生物对污染更为敏感。同时KUPERMAN和CARREIRO在多种重金属污染的草地生态系统所做的调查表明，大多数污染土壤中微生物量较低，重金属污染对土壤微生物活性和丰富度存在不利的影响，从而影响到有机物质降解与营养物质循环[5]。但土壤微生物群落的变迁受多种因素制约，重金属因素仅能部分解释微生物群落变化。赵祥伟等[6]分析了冶炼厂附近Cu、Cd、Pb、Zn复合污染农田微生物的遗传多样性，结果发现重金属与多样性间不是简单的负相关关系，最大的多样性指数出现在中等污染程度的土壤中。Del V等[7]研究了含重金属污泥的长期污染对菌根真菌的影响，研究发现大量施用污泥降低了真菌多样性指数，然而污泥中等施用量反而增加了真菌丰富度与Shannon-Wiener指数。因此本研究基于这样一个背景之下，从农田物质的生物循环角度，考察重金属污染对微生物代谢功能的影响，进而探讨重金属污染对农田物质循环的可能影响。

1 材料和方法

1.1 土壤样品的采集和处理

采样点位于福建省龙岩市某冶炼厂附近农田，农田主要种植叶菜类，土壤大部分为粘壤。沿污灌渠，从两岸农田随机抽取11个表层土壤样品（≤20cm），运回实验室。剔除杂物后过2mm筛，迅速进行微生物群落代谢功能分析，以及土壤理化性质分析。部分样品风干、研磨后过0.1mm筛，进行重金属含量分析。

1.2 土壤理化性质及重金属含量分析

采用碱解扩散法测定土壤碱解氮；钼蓝比色法测定速效磷；醋酸铵提取火焰分光光度法测定速效钾；重铬酸钾氧化法测定有机质；电位法测定土壤pH值；柠檬酸盐-连二亚硫酸钠碳酸氢钠法测定游离铁；土壤有效Cu、Cd、Pb、Zn、Ni和Co采用DTPA法提取测定[8]。

1.3 土壤微生物碳源代谢和功能多样性分析

采用Biolog生态板分析微生物碳源代谢特性。按照说明书中的步骤进行土壤预处理并接种于生态板，28℃培养。分别在0、24、48、72、96、120、144和168h，使用酶标仪（TECAN-F50）于590 nm读取平板上每个孔的OD值。

平均显色（AWCD）计算为：AWCD=Σ（C-R）/n，其中C和R分别是响应孔（含某一碳源）和对照孔（无碳源）的OD值，n是响应孔的数目。Shannon-Wiener多样性指数（H'）计算为：H'=-ΣPiln Pi，其中Pi是第i孔OD值变化和所有孔OD值变化和的比值，即Pi=（C-R）/Σ（C-R）。Shannon even（E）计算为：E=H'/ln S，其中S是在孵育时间内OD值变化的孔的数目。Simpson多样性指数计算为：D=N（N-1）/Σ[ni（ni-1）]，其中ni是第i孔的OD值，N是生态板所有孔OD值总和。上述3项多样性指数均采用96h的OD值计算。

1.4 数据分析

所有实验数据均由Excel和SPSS的统计软件处理，采用单因素方差分析检验5％最小显著性差异（LSD）。

2 结果

2.1 农田营养元素及重金属含量状况

分析结果见表1，11个样品中有效态Cu浓度从7.16mg/kg到82.63mg/kg，平均值为20.94mg/kg。有效态Cd浓度在0.10mg/kg和1.47mg/kg之间变化，平均值为0.73mg/kg。有效态Pb浓度在8.23mg/kg和220.92mg/kg之间，平均值为71.29mg/kg。有效态Zn浓度在11.89mg/k与155.13mg/k之间,平均值为66.69mg/kg。有效态Ni浓度从0.13mg/kg变为0.65mg/kg，平均值为0.35mg/kg。有效态Co浓度在0.02mg/kg与0.33mg/kg之间，平均值为0.08mg/kg。这些数据表明，本研究所选样地的土壤均遭到一定程度的重金属污染。

土壤中游离态Fe含量从14.65mg/kg到53.41mg/kg，平均值为29.76mg/kg。有效态P从33.01mg/kg至162.83mg/kg，平均值为116.92mg/kg。有效态K从73.18mg/kg至637.98mg/kg，平均值为248.34mg/kg。碱解N含量从96.66mg/kg到222.78mg/kg，平均值为141.28mg/kg。比照《全国第二次土壤普查养分分级标准》（可见下表2）可知，除4号样品的有效态P含量只达到二级标准外，其余样品均达到一级标准；2号、4号、5号和11号的有效态K含量达到四级标准，1号和3号样品达到三级标准，6号样品达到二级标准，其余样品均超过一级标准；1号、2号、4号和5号样品的碱解N含量达到三级标准，3号、6号和11号样品达到二级标准，其余样品均超过一级标准。说明待测土壤养分含量相对较高，土壤较为肥沃。

表1 土壤样品的营养元素和重金属含量单位：mg/kgTable 1 Heavymetals and basic properties of soil samples

表2 全国第二次土壤普查养分分级标准Table 2 The second national soil grading standards

2.2 微生物代谢强度的变化

碳源代谢特征（AWCD）的变化能很好的反映土壤微生物群落功能的变迁，其颜色变化的速度快慢能反映微生物土壤微生物代谢强度高低。土壤样品31个碳源AWCD的变化特征总体上随培育时间增加而增加，具体表现为：从48h到96h间土壤微生物具有很高的代谢活性；随后放缓，168h后，AWCD达到最大显色水平。

在分析了AWCD变化特征与有效态重金属、速效营养元素的相关性后（分析结果可见表3），发现：Cd具有对微生物群落最大的影响，Zn位居第二位，Pb具有较弱的效果。由于土壤样品中Cu含量较低，Cu与微生物碳代谢之间的关系不明确。速效P对微生物活性有显著的影响，但速效N和速效K的影响较弱。在培育时间上则表现为：96h AWCD与有效态Cd和Zn显著正相关，但与有效态P显著负相关。120h AWCD与有效态Cd和Zn正相关，并与速效P负相关。这结果表明，Cd和Zn和有速效P是影响土壤微生物代谢多样性的两个主要因素：Cd和Zn刺激微生物代谢，速效P降低生物代谢。

2.3 微生物群落功能多样性的变化

土壤样品的微生物功能多样性指数及相关性分析如表4和表5所示。通过相关性分析可知Shannonwiener指数和Simpson指数在96h时与所有31个碳源中的23个碳源的AWCD显着正相关，与有效态Cd正相关，但与速效P负相关。该结果说明有效态Cd可增加生物群落的功能多样性，速效P降低农田中微生物群落的功能多样性。

表3 6种碳源的相关系数Table3 Correlation coefficientsin 6 typesofcarbon sources

表4 在96h时土壤微生物碳源代谢的多样性Table 4 Diversities of soilmicrobial carbon sourcesmetabolizing at 96h

3 讨论

重金属污染对土壤微生物群落的影响极大。其影响效应包括微生物数量和多样性的下降，微生物群落结构和代谢功能的改变[9]。本研究表明有效态重金属（Cd和Zn）和有效态养分（速效P）是影响土壤微生物代谢多样性的主要因素。重金属（Cd和Zn）刺激微生物代谢，速效P降低微生物代谢。Cd可增加土壤微生物群落的功能多样性；含量过高的营养元素（如速效P）会降低土壤微生物多样性。

相比于其他生物指标，AWCD更适合反映研究中微生物群落的变化。前人的研究表明碳源利用和微生物群落的代谢功能多样性受到高浓度重金属的显着抑制[5]。但本研究发现，Cd和Zn明显刺激土壤微生物的代谢活动。产生这个结论的原因可能有两个：一方面本研究所选的受重金属污染的农田土壤，其重金属浓度相对低于KUPERMAN等人[5]的研究样品；另一方面，所选用样品的营养元素和有机物含量较KUPERMAN等人[5]研究的土壤样品更高（见表1）。在高肥力土壤中可能存在更多品种和数量的微生物，这可能为微生物群落提供更强的抗干扰的能力[11]。在长期污水灌溉农田中进行的一项研究也表明，Cr和Zn浓度与AWCD值和微生物多样性呈正相关[12]。

重金属污染对农田土壤微生物的代谢特性和功能多样性的影响较为复杂，但从本研究结果来看中度重金属污染和较为肥沃的土壤中Cd和Zn明显刺激土壤微生物的代谢活动，增加功能多样性，同时，含量过高的营养元素（如速效P）会降低土壤微生物代谢活动和多样性。这一结论可为后续的研究提供一定的参考价值，同时，在田间条件下，多种环境因素同时作用于微生物群落，重金属、营养元素对土壤微生物的代谢特性和功能多样性的影响与其他因子之间的关系仍需进一步研究。

[1]BIAN Z F，INYANG H I，DANIELS J L，et al．Environmentalissues from coalmining and their solutions[J]．Mining Science and Technology，2010(20)，215-223.

[2]王广林,王立龙,王育鹏,等.冶炼厂污灌区土壤铜和锌污染与土壤酶活性[J].应用生态学报,2005,16(2)∶328-332.

[3]KANDELER E,TSCHERKO D,SPIEGEL H.Long-term monitoring of microbial biomass,N mineralisation and enzyme activities of a Chernozem under different tillage management[J].Biology and Fertility ofSoils,1999,28(4):343-351.

[4]JONER E J,EIDHUSET T D,LANGEL H,et al.Changes in the microbial community in a forest soil amended with aluminium in situ[J].Plant and Soil,2005(275):295-304.

[5]KUPERMAN R G,CARREIRO M M.Soil heavy metal concentrations,microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem[J].Soil Biology and Biochemistry,1997,29(2):179-190.

[6]赵祥伟,骆永明,滕应,等.重金属复合污染农田土壤的微生物群落遗传多样性研究[J].环境科学学报,2005,25(2):186-191.

[7]DEL V,BAREA JM,AZCóN-AGUILAR C.Diversity of arbuscular mycorrhizal fungus populations in heavy-metalcontaminated soils[J].Applied and Environmental Microbiol-ogy,1999,65(2):718-723.

[8]GB/T 17138—1997.土壤质量铜、锌的测定火焰原子吸收分光光度法[S].北京:国家环境保护局,1997.

[9]LOCK K,JANSSEN C R.Influence of soil zinc concentrations on zinc sensitivity and functional diversity ofmicrobial communities[J].Environmental Pollution,2005(136):275-281.

[11]GIRVAN M S,CAMPBELL C D,KILLHAM K,et al.Bac

terial diversity promotes community stability and functional resilience after perturbation[J].Environmental Microbiology,2005(7):301-313.

[12]ZHANG Y L,DAIJL,WANG R Q,et al.Effects of longterm sewage irrigation on agricultural soilmicrobial structural and functional characterizations in Shandong,China[J].European Journal of Soil Biology,2008,44:84-91.

（责任编辑：华伟平）

Study on Carbon M etabolism and Functional Diversity of M icrobial Community in SewageW ater Irrigated Farm land Soil

LIN Li，WANG Han
（College Of Ecology and Resource Engineering,Wuyi University,Wuyishan,Fujian 354300）

For the study of themicrobialmetabolism and functional diversity in sewage water irrigated farmland soil,nutrient content and heavy metal content are investigated in the farm land near the smelting plant,the diversity ofmicrobialmetabolic characteristics and functions aremeasured by Average Well Color Development(AWCD),Shannon-wiener index and Simpson index.The result showes that the farm land soilwasmildly ormoderately polluted by Cu,Cd,Pb and Zn.Cd,Zn and available P are themajor factors affecting the diversity of soilmicrobialmetabolism,heavy metal stimulates the microbialmetabolism,available P reduces the biologicalmetabolism.Cd could increase the functional diversity of soilmicroflora,while high content of nutrient elements(such as available P)will reduce the soil microbial diversity.

heavymetal pollution;microbialmetabolic characteristics;microbial functional diversity;farmland soil

Q89

：A

：1674－2109(2017)06－0039－05

2017-02-27

高效脱氮菌的筛选及其复合菌的构建（JA15528）。

林立（1987-），男，汉族，助教，主要从事景观生态学、土壤生态学等方面研究。

王涵（1970-），男，汉族，讲师，主要从事环境微生物方面研究。