胎盘FAT/CD36表达与巨大儿发生的相关性

王晨晨，李一美，孙昊，蔡倩莹，徐小茜，王耀成，王玉环，闫洪涛，杨新军

（1.温州医科大学 公共卫生与管理学院，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 产科，浙江 温州 325027）

胎盘FAT/CD36表达与巨大儿发生的相关性

王晨晨1，李一美2，孙昊1，蔡倩莹1，徐小茜1，王耀成1，王玉环2，闫洪涛1，杨新军1

（1.温州医科大学 公共卫生与管理学院，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 产科，浙江 温州 325027）

目的：探讨胎盘组织中脂肪酸转位酶（FAT/CD36）表达与巨大儿发生的关系。方法：选择2014年6月至2016年6月在温州医科大学附属第二医院育英儿童医院正常妊娠并足月分娩的89例产妇和新生儿为研究对象，其中44例为巨大儿，45例为正常儿。采用自制调查表收集产妇和新生儿的基本信息，并收集胎盘样品。采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术及Western blot法检测巨大儿与正常儿胎盘组织中FAT/CD36基因和蛋白的表达水平，采用多因素logistic回归进行巨大儿发生的影响因素分析。结果：qPCR和Western blot结果显示，巨大儿组FAT/CD36表达水平高于正常儿（P＜0.05）。多因素logistic回归分析表明，胎盘FAT/CD36基因mRNA高表达为巨大儿发生的危险因素，且与孕周、孕期体质量增加、新生儿性别共同影响巨大儿的发生。结论：FAT/CD36在胎盘组织中表达上调可能是导致巨大儿发生的机制之一。

FAT/CD36；巨大胎儿；胎盘

巨大儿是指出生体质量≥4 000 g的活产新生儿[1]。一项基于14个省38家医院的回顾性调查显示，2011年中国巨大儿发生率为7.3%[1]，且近年来巨大儿的发生率呈增长趋势[2]。巨大儿不仅会显著增加死胎、胎儿死亡（出生窒息导致）、出生损伤、胎粪吸入和剖宫产等产科问题[3]，而且会增加其成年后患糖尿病、肥胖等代谢性疾病的风险[4-5]。然而，巨大儿发生的原因和机制仍不清楚。因此，开展巨大儿发生的病因学研究，进一步揭示巨大儿的发生机制，对预防和控制巨大儿及其成年期疾病的发生具有重要的意义。脂肪酸是胎儿生长发育必需的营养物质，是人体细胞重要的能量来源。一项孕期高脂肪膳食导致小鼠肥胖模型的研究显示，胎盘营养素能高效地运输给胎儿，从而引起胎儿的过度生长[6]。胎儿脂肪酸水平不仅受母体脂肪酸水平影响，还受胎盘转运效率的影响[7]。脂肪酸转位酶（fatty acid translocase，FAT/CD36）作为一种跨膜蛋白，可通过改变长链脂肪酸（long-chain fatty acid，LCFA）的转运和氧化代谢过程来调节胎盘脂肪酸代谢。但是，在巨大儿发生中是否有脂肪酸代谢异常，尚不清楚。因此，本研究通过检测胎盘FAT/CD36的表达水平，探讨其对LCFA转运的影响及与巨大儿发生的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 采用病例对照研究设计，选择2014年6月至2016年6月于温州医科大学附属第二医院育英儿童医院进行常规产前检查并在该院分娩的89例产妇及单胎足月新生儿。其中，巨大儿组为出生体质量≥4 000 g的新生儿，共44例；对照组为出生体质量在2 500～3 999 g，且与巨大儿分娩时间相差3 d以内的新生儿，共45例。入选标准：正常妊娠、单胎、足月分娩，糖耐量试验正常，新生儿无先天畸形。排除标准：妊娠合并症者（如糖尿病、高血压、心脏病等）、妊娠并发症者（如胎盘异常、先兆子痫等）和新生儿先天畸形。本研究得到了医院伦理委员会批准，所有产妇均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集：采用自行设计的调查表收集产妇和新生儿的基本信息，内容包括产妇生产年龄、身高、孕前体质量、孕前体质量指数（body mass index，BMI）、孕期体质量增加、分娩方式、新生儿出生体质量及其他相关信息。

1.2.2 胎盘样品采集与处理：胎盘娩出后，立即无菌操作取胎盘滋养层组织1 cm×1 cm×1 cm，放入经DEPC处理过的冻存管中，加入RNAlater（美国Ambion公司）保存，液氮运输，并保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 胎盘RNA提取、反转录和qPCR检测：用Trizol法提取胎盘总RNA，取5 μg总RNA进行反转录。采取qPCR法测定胎盘FAT/CD36表达水平，选取GAPDH作为内参基因，设计相应引物进行PCR扩增鉴定，引物至少跨1个内含子，以免基因组DNA污染。所用引物序列如下：FAT/CD36上游：5’-GGGTT ACATTTTCCTTGGCTAGAA-3’，下游：5’-GCAGCAACATTCAA GTTAAGCAA-3’[8]，产物片段长度为76 bp；GAPDH上游：5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’，下游：5’-AGTC CTTCCACGATACCAAAG-3’[9]，产物片段长度为113 bp。 qPCR反应体系为20 μL：SYBR Premix Ex TapTM（2×）10 μL；引物（10 μmol/L）各1 μL；cDNA 1 μL；加去离子水至20 μL。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃5 s，60 ℃ 30 s共40个循环。PCR产物经溶解曲线与琼脂糖凝胶电泳分析，以保证产物的特异性。每个样品做3个平行管，采用2-△△CT法进行数据处理。

1.2.4 Western blot法检测胎盘组织中FAT/CD36表达水平：取胎盘组织PBS洗涤2次，弃上清，加入RIPA裂解液裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液测定蛋白质浓度，调整浓度一致，蛋白变性后-20 ℃保存。经SDS-PAGE后，电转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h，兔抗人抗体一抗（美国Abcam公司）1∶2 000孵育过夜，TBST洗膜3次每次10 min，用山羊抗兔二抗（美国Abcam公司）1∶5 000常温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，使用增强化学发光液显色，用凝胶成像系统采集图像，采用Quantity one凝胶图像分析系统对图像中蛋白条带的灰度值进行分析。

1.3 统计学处理方法 问卷调查资料和实验数据统一录入EpiData 3.1数据库，运用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料如呈正态分布，则以±s表示，若呈非正态分布用中位数（最小值，最大值）表示。计量资料采用成组t检验或Mann-Whitney U检验；计数资料采用χ2检验或秩和检验。采用单因素和多因素logistic回归分析巨大儿的影响因素，以优势比（odd ratio，OR）和95%可信区间（confidence interval，CI）来估计巨大儿发生危险因素的危险度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 2组间产妇生产年龄、新生儿性别、分娩方式、孕期体质量增加，差异有统计学意义（P＜0.05），其他因素如孕前体质量、身高、孕前BMI、孕周、产次在2组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 胎盘FAT/CD36基因mRNA表达 qPCR检测结果显示，巨大儿组FAT/CD36的mRNA表达量高于对照组，差异有统计学意义（Z=-3.340，P＜0.001），见图1。进一步分析显示，在男性新生儿中，巨大儿组FAT/CD36基因mRNA表达量为1.66（0.42，5.75），高于对照组的1.04（0.26，2.81），差异有统计学意义（Z=-3.202，P＜0.001）。而女性新生儿中，巨大儿组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 产妇及新生儿临床资料比较

图2 2组胎盘FAT/CD36蛋白表达

2.4 巨大儿发生的影响因素分析 结合基线资料，采用多因素logistic回归模型，对影响巨大儿发生的因素进行筛选与分析。以是否为巨大儿为因变量，其他因素如新生儿性别、孕周、FAT/CD36基因mRNA表达量等为自变量进行logistic回归分析。结果显示，在控制了新生儿性别、孕周、孕期体质量增加之后，胎盘FAT/CD36基因mRNA高表达为巨大儿发生的危险因素，且与孕周、孕期体质量增加、男性新生儿共同影响巨大儿的发生，见表2。

3 讨论

FAT/CD36又称为FAT、GP4、GP3B、PASIV等，是一种可以转运LCFA的单链跨膜细胞表面蛋白。人的FAT/CD36含471个氨基酸残基，由于糖基化程度不同，在不同的细胞中具有不同的分子量，为78～88 kDa[11]。FAT/CD36属于B类清道夫受体家族蛋白成员之一，其配体包括低密度脂蛋白、天然脂蛋白、氧化的磷酸和长链脂肪酸等，FAT/CD36广泛分布于脂肪、骨骼肌、胎盘等脂肪酸代谢活跃的组织中[12]。有研究发现，FAT/CD36敲除的小鼠骨骼肌和脂肪组织摄取和利用LCFA的速率显著下降。当FAT/CD36在小鼠骨骼肌细胞中过量表达时，肌细胞摄取脂肪酸的速率大幅度提高，这说明FAT/CD36在LCFA的转运过程中发挥着重要作用[13]。还有研究表明，FAT/CD36在调节心脏和骨骼肌中的LCFA利用过程中起到关键作用[14]。

由于胎儿自身合成LCFA功能有限，胎儿体内LCFA主要来自胎盘转运。胎盘LCFA的被动扩散需借助载体蛋白转运，包括胎盘脂肪酸转位酶FAT/ CD36、脂肪酸转运蛋白（fatty acid transportprotein，FATPs）、脂肪酸结合蛋白（fatty acid binding protein，FABPs）等，但只有FAT/CD36和FATP是位于绒毛膜和基底膜上，涉及到LCFA跨过整个胎盘的转运[15]。本研究发现，胎盘组织中FAT/ CD36的mRNA表达量和蛋白水平在巨大儿组中明显上调，FAT/CD36可能是通过促进LCFA在胎盘中的转运，加速胎儿的生长和脂肪沉积，从而参与影响了巨大儿的发生。另外我们还发现在男性新生儿中，巨大儿比对照组FAT/CD36 mRNA表达上升，而女性新生儿中差异无统计学意义。这可能是由于男性胎儿对脂肪酸需求高于女性胎儿[16]，于是FAT/CD36高表达可以转运更多脂肪酸来满足男性胎儿的生长发育，这也可以解释目前研究发现巨大儿中男性新生儿多于女性新生儿的现象。目前关于代谢性疾病与FAT/CD36关系的研究结果显示，FAT/CD36高表达与胰岛素抵抗、脂肪分化都有密切的关系，在肥胖和2型糖尿患者群中，脂肪组织的FAT/CD36表达都高于正常人[17]。而出生为巨大儿的新生儿，其身体脂肪含量高于正常体质量的新生儿[18]，并且巨大儿还可能增加儿童时期肥胖和成年后代谢性疾病的发病风险[19]。本研究发现的巨大儿胎盘FAT/CD36高表达，可能是巨大儿成年后易患代谢性疾病的一个间接证据，但具体机制还需要进一步研究证明。

表2 巨大儿影响因素的logistic回归分析

本研究还分析了影响巨大儿发生的其他因素，与以往研究[20-21]相一致，男性新生儿、孕周延长、孕期体质量增加为巨大儿发生的危险因素。此外，在控制了新生儿性别、孕周、孕期体质量增加后，胎盘FAT/CD36基因mRNA高表达显示为巨大儿发生的独立危险因素，提示脂肪酸转运参与了巨大儿的发生。

本研究也存在一些不足。由于本研究是一项以医院为基础的病例对照设计，可能会存在选择偏倚，为了控制选择偏倚，我们连续收集了本院2014 年6月至2016年6月能保证获得全部信息的巨大儿为研究对象。另外，由于研究的样本量有限，多因素分析模型中危险度估计的可信区间较宽，可能会影响估计的精确性。

综上所述，FAT/CD36基因的 mRNA和蛋白表达水平在巨大儿胎盘组织中呈现明显高表达，提示FAT/CD36基因可能参与了胎盘LCFA的转运从而调节新生儿出生体质量，影响巨大儿发生。这为寻找巨大儿发生原因及其成年后代谢相关疾病的发生机制，提供了新的理论依据。

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（本文编辑：贾建敏）

Correlation between FAT/CD36 expression in placenta and macrosomia

WANG Chenchen1, LI Yimei2, SUN Hao1, CAI Qianying1, XU Xiaoxi1, WANG Yaocheng1, WANG Yuhuan2, YAN Hongtao1, YANG Xinjun1.
1.Department of Preventive Medicine, School of Public Health and Management, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Department of Obstetrics, the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To explore the correlation between expression of FAT/CD36 in placenta and macrosomia.Methods:The cases were collected from June 2014 to June 2016 in the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, including 44 macrosomia newborns and 45 normal birth weight newborns. A self-designed questionnaire was used to collect related information of pregnant women and their neonates, real-time fl uorescent quantitative PCR (qPCR) was used to detect FAT/CD36 mRNA expression in placenta. Western blot was used to detect FAT/CD36 protein expression. The infl uencing factors of macrosomia were analyzed by multivariate logistic regression model.Results:qPCR and Western blot showed FAT/CD36 expression of macrosomia was signifi cantly higher than that of healthy controls (P＜0.05). The result of multivariate logistic regression analysis showed that high expression of FAT/CD36 mRNA expression was a risk factor, and the occurrence of macrosomia was infl uenced by gestational age, gestational weight gain and newborns sex.Conclusion:The up-regulation of FAT/CD36 in placenta may be correlated with macrosomia.

FAT/CD36; fetal macrosomia; placenta

R114

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.06.006

2016-10-31

国家自然科学基金资助项目（81072378）；浙江省自然科学基金资助项目（Y2101185）。

王晨晨（1991-），女，河南洛阳人，硕士生。

杨新军，教授，Email：xjyang@wmu.edu.cn。