miRNA-10a对小鼠肝纤维化细胞增殖及TGFβ1/Smads信号转导通路表达的影响

邓国孙，李镇伽



·基础医学· ·论著·

miRNA-10a对小鼠肝纤维化细胞增殖及TGFβ1/Smads信号转导通路表达的影响

邓国孙，李镇伽

目的 通过观察肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)小鼠肝组织TGFβ1/Smads信号转导通路的表达与HF进展的关系，探讨微小RNA(microRNA，miRNA)-10a对于HF的作用机制。方法 选用9周龄健康雄性小鼠(C57BL6/J)40只，按照数字表法随机分为对照组和HF模型组(观察组)，对照组生理盐水5 μl/g腹腔注射，每周2次，注射8周；观察组10% CCL4橄榄油5 μl/g腹腔注射，每周2次，注射8周，制作小鼠HF模型。RT-PCR法检测HF细胞中miRNA-10a表达后，将观察组HF细胞进行培养及miRNA-10a模拟物转染(转染组)，CCK-8法检测HF细胞增殖能力，Western blotting检测HF细胞中TGFβ1、Smad7的表达水平。结果 与对照组比较，观察组miRNA-10a表达水平明显增加(P<0.05)；与对照组比较，转染组肝细胞miRNA-10a表达水平明显降低(P<0.05)；与对照组相比，低表达miRNA-10a明显降低观察组TGFβ1的表达水平，提高Smad7的表达水平(均P<0.05)。结论 小鼠HF细胞中低表达miRNA-10a，转染miRNA-10a模拟物可明显促进小鼠HF细胞增殖，其作用机制是通过miRNA-10a调控TGFβ1/Smads信号转导通路促进小鼠HF。

肝纤维化；转化生长因子β1；Smad7蛋白；TGFβ1/Smads信号转导通路

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是机体对各种原因诱发的慢性肝细胞损伤后的一种自我修复反应。有研究[1]显示，HF是一个可逆的病理生理过程，消除相关致病因素或有效的早期干预治疗可改善HF程度，反之则可进展为终末失代偿期肝硬化。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类大小为18～22个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，通过与靶mRNA完全或不完全互补配对，引起mRNA降解或翻译抑制，从而能在转录后水平调控机体基因的表达[2]。有研究[3]显示，一些miRNA在肝细胞内表达相对丰富，并在疾病的进展中表达有明显差异，从而影响肝脏疾病的发生发展。也有研究[4-5]表明，miRNA-10a参与造血细胞的分化、肿瘤的发生发展、免疫功能的调节等多个病理生理过程。在博莱霉素所致的肺纤维化小鼠肺组织中，发现了161个差异表达的miRNA，其中miRNA-10a通过调节TGF-β信号通路参与调控纤维母细胞激活和胶原沉着[6]。有文献[7]报道，肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活或表型转化为成纤维细胞是HF形成的中心环节，转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGFβ1)是公认的最强致HF的细胞因子之一[8]，Smad蛋白是TGFβ1关键的作用底物[9]，可诱发HSC激活，启动胶原基因表达，从而导致HF的发生。TGFβ1/Smads信号转导通路的激活及引起的相应病理变化, 在HF的发生发展中具有非常重要的意义[10]。本研究探讨miRNA-10a调控HF的分子机制，并将miRNA-10a作为HF药物靶点，从而指导HF的诊断与治疗。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 Pronase E购于美国Merck公司，Collagenase II购于美国Sigma公司，淋巴细胞分离液购自中科院生工所，DMEM培养液及干粉购于GIBCO公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，Interferin siRNA转染剂购自Polypus公司，miRNA分析系统购自Applied 公司，PrimeScript RT-PCR反转录试剂盒购自TOYOBO公司，miRNA-10购于广东锐博公司，各类单抗均购于美国Abcam公司，细胞裂解液CLB购自Cell Signaling T公司。

1.2 建立HF小鼠模型 选用9周龄健康雄性小鼠(C57BL6/J)40只，体质量19～22 g，按照随机数字表法分为对照组和HF模型组(观察组)，对照组生理盐水5 μl/g腹腔注射，每周2次，注射8周；观察组10% CCL4橄榄油5 μl/g腹腔注射，每周2次，注射8周，制作小鼠HF模型。

1.3 制备标本 实验小鼠禁食12 h，在乙醚麻醉下，断头取血，部分肝脏组织采用10%中性甲醛固定，备制病理切片，其余肝组织液氮快速冷冻，置于-80 ℃冰箱保存，备用。

1.4 HSC分离 75%酒精消毒腹部皮肤后，2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)小鼠腹腔注射，十字切口开腹，充分暴露小鼠心脏和下腔静脉，18号套管针连接输液瓶，从左心室进针注入灌注液，下腔静脉放血，10 ml/min流速肝脏灌流，直至肝脏变为土黄色，随后采用酶灌注液继续灌流14～18 min，直至肝脏呈现烂泥状，取肝脏，生理盐水冲洗后，剔除肝脏包膜及结缔组织，剪碎后加入振荡消化液，37 ℃振荡20 min，200×g离心5 min，细胞悬液经300目钢网过滤后，收集于2个30 ml离心管中,1 400×g离心5 min，弃上清，D-Hanks液重悬沉淀，取上清进行梯度分离。采用淋巴细胞分离液铺梯度，上层加充分消化的单细胞悬液，25 ℃，1 500×g离心25 min，平抛离心后的分离细胞，小心吸出中层少量白色液体，即为HSC。DMEM制备，1 400 ×g离心10 min，洗涤2次，以1.0×106个细胞接种于100 ml塑料培养瓶中24 h，静置培养72 h后换成含10%胎牛血清DMEM培养液，每3 d更换培养液1次。采用台盼蓝进行染色，计算细胞成活率，以2组小鼠HSC成活率均达到90%以上表示分离成功。

1.5 Real-time PCR检测miRNA-10a表达 采用TRIzol试剂，提取2组肝组织总RNA，利用SYBR Premix ExTaq荧光定量PCR试剂盒及LightCycler仪器，进行操作及分析。miRNA-10a逆转录引物序列：5’-GTCGTATC-CAGCAGGGTCCGTATTCGCACTGGATACGACACA-3’；miRNA-10a定量引物上游序列：5’-ACGTACCTGTAGATCCG-3’，引物下游序列：5’-GTG-CAGGTCCGAGGT-3’。U6逆转录引物序列：5’-CGCTCACGAATTTGCGTGTAT-3’；U6定量引物上游序列：5’-CTCGCTTCGCAGCACA-3’，引物下游序列：5’-AACGCTTCACGAATTTCGT-3’。按3步法进行DNA扩增，反应条件：95 ℃、20 s；94 ℃、25 s；55 ℃、15 s；75 ℃、10 s；40次循环条件：72 ℃、10 min。每次Real-timePCR被测标本的Ct值减去对应样品中U6Ct值，即为ΔCt，HF细胞中miRNA-10a的表达量采用2-ΔΔCt计算，HF组织标本中miRNA-10a表达量采用log22-ΔΔCt计算。

1.6 HF细胞培养和miRNA-10a模拟物转染 小鼠HF细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱进行传代培养。将处于对数期生长的HF细胞接种于12孔板，每孔细胞密度为3×105个，当细胞生长融合度至50%时，再将其分为2组，一组为miRNA-10a模拟物转染组，一组为对照组，分别用含有miRNA-10a模拟物和对照miRNAOpti-MEM培养基转染细胞，同时加入Interferin提高转染率。转染时每孔miRNA-10a模拟物或对照miRNAOpti-MEM的终浓度均为20 nmol/L，Interferin为4 μl，转染72 h。本实验重复3次。

1.6 CCK-8法检测HF细胞的增殖能力 根据CCK-8试剂盒说明书操作，HF细胞转染miRNA-10a模拟物或对照miRNA Opti-MEM 72 h后，将2组细胞根据每孔2×104个，接种于96孔培养板中，并各设置3个平行孔，3～5 h后细胞贴壁，加入100 μl 1640培养液、10 μl CCK-8，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养2 h，酶标仪测定光密度(D)值。本试验重复3次。

1.7 Western blotting检测HF细胞中TGFβ1、Smad 7蛋白的表达 HF细胞转染72 h后，收集转染组和对照组待测细胞，细胞裂解液裂解，BCA法测定蛋白浓度，取50 μg蛋白经8% SDS-PAGE分离后，转至PVDF膜，25 ℃封闭1 h，分别加入TGFβ1抗体(1∶2 000)、Smad 7抗体(1∶2 000)、β-actin抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜后加过氧化物酶标记的二抗，25 ℃孵育1h，洗膜后ECL法显影，Gene gnome采集图片，利用Image J软件进行灰度分析。本试验重复3次。

1.8 统计学处理 采用SPSS 18.0统计学软件，数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-10a在小鼠HF中高表达 Real-time PCR检测观察与对照组中miRNA-10a相对表达量，结果显示，观察组HF组织中miRNA-10a表达量明显高于对照组[(-7.84±1.38)vs(-9.97±1.59)，P<0.05]。

2.2 转染miRNA-10a模拟物后HF细胞miRNA-10a的表达 Real-time PCR检测转染组及对照组中miRNA-10a的相对表达量，结果(图1)显示，转染组(miRNA-10a mimics)HF细胞miRNA-10a表达量明显低于对照组(P<0.01)。

注：与对照组比较aP<0.01图1 Real-time PCR检测2组肝细胞miRNA-10a表达水平

2.3 低表达miRNA-10a促进HF细胞增殖 为了研究低表达miRNA-10a对HF细胞增殖的影响，利用CCK-8法检测转染组及对照组HF细胞的增殖水平，结果(图2)显示，与对照组相比，低表达miRNA-10a的HF细胞增殖水平明显提高(P<0.05)。

注：与对照组比较aP<0.05图2 CCK-8法检测转染组及对照组HF细胞的增殖情况

2.4 miRNA-10a调控TGFβ1/Smads信号转导通路 Western blotting检测转染miRNA-10a模拟物后HF细胞中TGFβ1、Smad 7蛋白的表达，结果(图3)显示，与对照组比较，转染组TGFβ1蛋白的表达量明显降低(P<0.05)，显示miRNA-10a上调HF细胞中TGFβl表达，而转染组Smad 7蛋白的表达量显著增多(P<0.05)，显示miRNA-10a下调Smad 7蛋白的表达。

注：与对照组比较aP<0.05图3 Western blotting检测miRNA-10a对TGFβ1/Smads表达的影响

3 讨论

有研究显示[11-12]，TGFβ1及其Smad信号转导通路与HF的发生发展密切相关，其中TGFβ1为双硫键结构的二聚体碱性蛋白，是激活HF细胞的主要细胞因子，也是最强的HF促进剂[13]；Smad蛋白是目前发现的TGFβ家族受体激酶的关键作用底物之一，根据其结构和功能的不同分为3类，其中抑制型Smad蛋白中的Smad 7主要功能为抑制TGFβ的转导通路。Smad 7可与活化的TGFβ1受体结合，抑制Smad蛋白磷酸化；进入胞浆Smad 7，使Smad蛋白不能与其受体相结合，在TGFβ信号转导中形成负反馈环路，从而发挥抗HF作用[14]。

研究[15-17]显示，miRNA参与HF的发生发展，但关于miRNA调控HF的分子机制还不是很清楚。miRNA-10a作为miRNA家族中成员之一，本研究显示，miRNA-10a在小鼠HF组织中高表达，并且低表达miRNA-10a能够促进HF细胞增殖，进一步表明miRNA-10a在HF中发挥着促纤维化因子的作用。本研究同时发现，与对照组相比，转染组TGFβ1蛋白表达明显降低，表明miRNA-10a上调TGFβ1的表达；而转染组Smad 7蛋白表达显著增多，表明miRNA-10a能够下调Smad 7表达，说明miRNA-10a通过调控TGFβ1/Smads信号转导通路发挥促HF作用，这为HF的治疗提供了潜在的治疗靶点。

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(本文编辑：王映红)

Effects of miRNA-10a on the proliferation of hepatic fibrosis cells and the expression of TGF beta 1/Smads signal transduction pathway in mice

DengGuosun,LiZhen′ga

(DepartmentofGastroenterology,ChongmingBranch,XinhuaHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai202150,China)

Objective To investigate the possible mechanism involved in the effect of micro RNA-10a(miRNA)on hepatic fibrosis (HF), through the observation on the expression of TGFβ1/Smads signal transduction pathway in mice with HF and its correlation with the development of hepatic fibrosis.Methods Forty healthy male mice with an age of 9 weeks (C57BL6/J) were randomly divided into the control group and the HF model group (or the observation group). The animals in the control group were given normal saline abdominally at a dosage of 5 μl/g, twice a week, for a succession of 8 weeks, while the animals in the observation group received 10% CCL4 olive oil also at a dosage of 5 μl/g with the same frequency and for the same length of time to develop the model of hepatic fibrosis. The expression of miRNA-10a was detected by RT-PCR. HF cells were cultured in the animals of the observation group and miRNA-10a mimics were transfected (the transfection group). CCK-8 method was used to detect the proliferation of HF cells, and the expression levels of TGFβ1 and Smad 7 in the HF cells were detected by Western-blotting. Results As compared with that of the control group, the expression level of miRNA-10a in the observation group was increased significantly (P<0.05); and as compared with that of the control group, the expression level of miRNA-10a in the transfection group were significantly decreased (P<0.05); and furthermore, as compared with that of the control group, the lower expression of miRNA-10a significantly decreased the expression level of TGFβ1 and increased the expression level of Smad 7(P<0.05).Conclusion The expression of miRNA-10a in the HF cells was lower, and the transfected miRNA-10a mimics could significantly promote the proliferation of HF cells, the possible mechanism of which might be associated with the regulation of TGFβ1/Smads signal transduction pathway in HF promotion.

Hepatic fibrosis; Transforming growth factor β1; Smad 7 protein; TGFβ1/Smads signal pathway

202150 上海，上海交通大学附属新华医院崇明分院消化内科(邓国孙)；南昌大学医学院第二附属医院普外科(李镇伽)

R575.3

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2017.03.013

2016-10-27)