茶叶提取物EGCG和GCG及ECG对B16细胞内黑色素生成的抑制作用

张向娜，林勇*，黄建安*，刘仲华，梁丹丹

(1.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；2.湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410128；3.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128)

茶叶提取物EGCG和GCG及ECG对B16细胞内黑色素生成的抑制作用

张向娜1,2,3，林勇1,2,3*，黄建安1,2,3*，刘仲华1,2,3，梁丹丹3

(1.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；2.湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410128；3.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128)

为研究茶叶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)、没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechingallate, GCG)和表儿茶素没食子酸酯(epicatechingallate, ECG)对体外培养B16小鼠黑色素瘤细胞黑色素生成及酪氨酸酶活性的影响，分别用不同浓度的 EGCG、GCG、ECG和熊果苷(Arbutin,AR)处理细胞，观察效应物对细胞形态的影响，用溴化二苯四偶氮法(MTT法)测定茶叶提取物对细胞增殖率的影响，以左旋多巴(L-DOPA)为底物，测定细胞内酪氨酸酶的活性，采用氢氧化钠裂解法测定细胞内黑色素的含量。结果显示，EGCG、ECG、GCG能显著抑制B16细胞的黑色素生成和酪氨酸酶的活性，且呈剂量依赖关系；当浓度为60 μg/mL时，细胞增殖率均低于50%，酪氨酸酶活性与对照组相比分别降低了26.67%、27.27%和32.71%，黑色素生成抑制率均在30%以上。结果表明，茶叶提取物能通过多种途径抑制黑色素生成，且GCG的作用效果最优，ECG的作用效果次之，三者的作用效果均优于熊果苷的作用效果。

茶叶提取物；表没食子儿茶素没食子酸酯；没食子儿茶素没食子酸酯；表儿茶素没食子酸酯；B16黑色素瘤细胞；黑色素生成；酪氨酸酶

健康、白皙的肌肤是东方女性理想的肌肤状态，而皮肤黑色素的含量及分布很大程度上影响着肌肤的呈色。皮肤黑色素主要由位于表皮基底层的黑色素细胞产生。皮肤受到紫外线照射后可激活黑色素细胞内酪氨酸酶的活性。随黑色素生成量的增加，肤色变深变暗，所以，酪氨酸酶是黑色素合成反应的关键酶，在黑色素的形成和沉积过程中起着重要作用[1-3]。随着化妆品行业的发展与成熟，消费者对美白产品的要求也不断提高。天然植物提取物具有良好的美白效果，且安全性好，已成为药学和化妆品行业研究的热点[4-5]。

茶叶中的EGCG、ECG、GCG等儿茶素类物质具有保健及药用功能。目前已有关于茶叶提取物对体外酶活性抑制作用的研究[6-8]，而以体外培养黑色素细胞为对象研究茶叶提取物对黑色素生成影响的报道尚少。国内仅有少数关于茶黄素(theaflavins,TFs)和EGCG美白效果的研究[9-10]。国外仅有GCG和ECG对体外蘑菇酪氨酸酶活性抑制作用的报道，而关于其对体内黑色素生成和酪氨酸酶活性抑制作用的研究尚少。本试验中建立体外培养B16黑色素细胞模型，研究EGCG、GCG和ECG对细胞内酪氨酸酶的作用及对细胞黑色素生成的影响，并与常用的美白剂熊果苷进行比较，以探明 EGCG、GCG及ECG的美白作用机制，为研制天然美白剂提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料和设备

1.1.1 材料

B16小鼠黑色素瘤细胞购于上海博谷生物科技有限公司；GCG、ECG、EGCG和熊果苷均购于南京泽朗医药科技有限公司。GCG、ECG、EGCG和熊果苷的纯度均大于等于98%。

1.1.2 主要仪器与试剂

主要仪器： CO2培养箱(Nuaire，美国)；倒置显微镜(Leica Microsystems，德国)；全波长扫描式多功能读数仪(Thermo Scientific，美国)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；多功能酶标仪(Thermo，美国)；普通离心机(Rotina，德国)；水平振荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；精密电子天平(Starorius，瑞士)；电热恒温水浴锅；高压蒸气灭菌锅；烘箱。

主要试剂：PBS粉剂；四甲基偶氮唑蓝(MTT，Amresco，美国)；二甲基亚砜(DMSO，Sigma，美国)；RPMI-1640 培养基；胎牛血清(FBS，Hyclone，美国)；胰蛋白酶(含0.05% EDTA，Gibco，美国)；左旋多巴(L-DOPA)；TritonX-100(Sigma，美国)；NaOH(分析纯，国药集团化学试剂公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养和传代

细胞的培养和传代参照文献[11]中的方法进行：在无菌条件下，将B16小鼠黑色素瘤细胞接种于含有10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养基中，于37 ℃、5%CO2、相对湿度98%的CO2培养箱培养，每天更换新鲜培养液1次。当细胞生长至汇合度为 80%～90%时，用 0.25%胰蛋白酶(含0.05%EDTA)消化细胞，传代培养，收集复苏后传代培养3代以上的对数期细胞，用于后续试验。

1.2.2 细胞形态的观察

细胞形态的观察参照文献[12]中的方法进行：待细胞生长至80%～90%融合状态，用0.25%胰蛋白酶消化，收集并制备单细胞悬液，用新鲜培养液调整细胞浓度为1×105个/mL，将细胞接种于96孔培养板中，每孔100 μL，置于CO2培养箱中培养过夜，细胞贴壁后弃上清液，用PBS漂洗1次，加入100 μL含有不同浓度受试物的新鲜培养液(GCG、ECG、EGCG、熊果苷的质量浓度均为 20、40、60、80、100 μg/mL)，每一浓度均设5个复孔，对照组以等量的新鲜培养液代替，置于CO2培养箱中继续培养。培养48 h后于倒置显微镜下观察试验组和对照组的细胞形态，并拍照记录。

1.2.3 细胞增殖率的测定

细胞增殖率的测定参照文献[13]中的方法进行：待细胞生长至80%～90%融合状态，用0.25%胰蛋白酶消化，收集并制备单细胞悬液，用新鲜培养液调整细胞浓度为1×105个/mL，将细胞接种于96孔培养板中，每孔100 μL，置于CO2培养箱中培养过夜，细胞贴壁后弃上清液，用PBS漂洗1次，加入 100 μL含有不同浓度受试物的新鲜培养液(GCG、ECG、EGCG、熊果苷的质量浓度均为5、10、20、40、60 μg/mL)，设对照组、GCG处理组、ECG处理组、EGCG处理组和熊果苷处理组，每一浓度均设5个复孔，对照组不加药物，以等量的新鲜培养液代替，置于 CO2培养箱中继续培养 48 h后弃上清，每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL及90 μL新鲜的无血清培养基。将细胞置于培养箱中继续培养4 h后弃去培养基和MTT，向各孔中加入100 μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡15 min，用酶标仪检测570 nm下各孔的OD值，计算细胞的增殖率。细胞增殖率=(试验孔OD570nm－空白孔OD570nm)/(对照孔OD570nm－空白孔OD570nm)。

1.2.4 细胞内酪氨酸酶活性的测定

细胞内酪氨酸酶活性的测定参照文献[14]中的方法进行。细胞处理方法同1.2.3。培养48 h后弃上清液，每孔加入含1%TritonX-100的PBS缓冲液90 μL，加入 10 μL 1 mg/mL 的左旋多巴(L-DOPA)，37 ℃孵育60 min后，用酶标仪检测475 nm下各孔的OD值。计算细胞内酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶活性=(试验孔 OD475nm－空白孔 OD475nm)/(对照孔OD475nm－空白孔OD475nm)。

1.2.5 细胞内黑色素含量的测定

细胞内黑色素含量的测定参照文献[15]中的方法进行：待细胞生长至 80%～90%融合状态，用0.25%胰蛋白酶消化，收集并制备单细胞悬液，用新鲜培养液调整细胞浓度为 1×106个/mL，将细胞接种于6孔培养板中，每孔2 mL，置于培养箱中培养过夜，细胞贴壁后弃上清液，用PBS漂洗1次。设对照组、GCG处理组、ECG处理组、EGCG处理组和熊果苷处理组，每一浓度均设3个复孔，加入2 mL含有不同浓度受试物的新鲜培养液(GCG、ECG、EGCG、熊果苷的质量浓度均为5、10、20、40、60 μg/mL)，对照组不加药物，以新鲜培养液代替，将细胞置于二氧化碳培养箱中继续培养。培养48 h后弃上清液，用PBS洗涤，用胰蛋白酶消化，收集细胞于离心管中，1 500 r/min离心10 min，弃上清液，加入1 mL含10%DMSO的1 mol/L NaOH溶液，80 ℃水浴1 h后，分别移入96孔培养板中，用酶标仪测定波长405 nm处各孔的光密度值，计算细胞内黑色素的含量。黑色素相对含量=(试验孔OD405nm－空白孔OD405nm)/(对照组OD405nm－空白孔OD405nm)。

1.3 数据分析

用Excel 2010 和SPSS 19.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 各处理B16 细胞的形态

传代培养的B16细胞多呈梭形贴壁生长。由图1可见，对照组细胞分裂现象明显，透明度高，细胞形态饱满，生长旺盛；分别加入不同浓度的GCG、ECG、EGCG 和熊果苷后，B16 细胞的形态均出现了一定程度的变化，细胞发生团缩，细胞间界限不清晰，并且随着浓度的增大细胞数目逐渐减少，细胞生长处于明显的抑制状态；在相同浓度下，GCG对细胞形态的变化影响最大，熊果苷的影响最小。当GCG、ECG 和EGCG 的质量浓度均为60 μg/mL时细胞数目显著减少，并有部分细胞漂浮；质量浓度为100 μg/mL时，大量细胞团缩成球形，无法贴壁生长。当熊果苷的质量浓度为100 μg/mL时，细胞生长呈抑制状态。根据细胞形态及数量的观察结果进行判断，GCG、ECG 和EGCG 的质量浓度低于60 μg/mL时，细胞能够正常生长。

图1 各处理B16细胞的形态Fig.1 Morphology of cells B16 under different treatments

2.2 各处理B16细胞的增殖率

由表1可见，3种茶叶提取物和熊果苷对B16细胞的增殖均有一定抑制作用，并随着浓度的增加抑制作用越明显。将对照组的细胞增殖率视为100%。ECG的作用效果最明显，在低浓度时就表现出了一定的抑制作用，质量浓度为5 μg/mL时细胞增殖率比对照组降低了27.61%；当GCG和EGCG的质量浓度为40 μg/mL、ECG质量浓度为60 μg/mL时，B16细胞的增殖呈明显的抑制状态，细胞增殖率均低于50%。与茶叶提取物相比，相同浓度熊果苷对细胞增殖的抑制作用不明显，熊果苷质量浓度为 60 μg/mL时，细胞增殖率仅比对照组降低了15.95%。可见，茶叶提取物可能通过抑制黑色素细胞的生长来达到美白的功效。

表1 各处理B16细胞的增殖率Table 1 Proliferation rate of cells B16 under different treatments

2.3 各处理B16细胞内酪氨酸酶的活性

由表2可见，3种茶叶提取物对B16 细胞内酪氨酸酶的活性均有不同程度的抑制作用，酶活性随受试物浓度的升高而降低，呈现出一定的剂量依赖关系。将对照组的酪氨酸酶活性视为100%。在相同浓度下，GCG 对 B16 细胞内酪氨酸酶活性的抑制效果最明显。当质量浓度为60 μg/mL时，GCG、ECG和EGCG细胞内酪氨酸酶的活性比对照组分别降低了32.71%、27.27%和26.67%。相同浓度下的熊果苷对细胞内酪氨酸酶的活性有抑制作用，其作用效果不如茶叶提取物的效果明显。据此推测，茶叶提取物可能在一定程度上通过抑制细胞内酪氨酸酶的活性来达到美白的功效。

表2 各处理B16细胞内酪氨酸酶的活性Table 2 Tyrosinase activity of cells B16 under different treatments

2.4 各处理B16 细胞内黑色素合成的相对量

由表3可见，3种茶叶提取物和熊果苷均能明显地抑制细胞内黑色素的生成。将对照组的黑色素生成量设为 100%。在相同浓度条件下，茶叶提取物对B16细胞内黑色素合成的抑制效果优于熊果苷的作用效果，3种茶叶提取物质量浓度为10 μg/mL时，其对细胞内黑色素生成的抑制作用均大于或相当于熊果苷质量浓度60 μg/mL的作用效果。总体来看，GCG 对黑色素生成的抑制作用效果相对较大，ECG 和EGCG 的抑制作用次之。由此推测，茶叶提取物可能通过抑制细胞内黑色素的生成来达到美白的效果。

表3 各处理B16 细胞内黑色素合成的相对量Table 3 Relative quantity of melanin in cell B16 under different treatments

3 结论与讨论

对茶叶提取物EGCG、GCG和ECG对B16小鼠黑色素瘤细胞的形态、细胞增殖率、细胞内酪氨酸酶活性及黑色素生成量影响的研究结果显示：EGCG、ECG、GCG能显著抑制B16细胞黑色素的生成和酪氨酸酶的活性，且呈剂量依赖关系，当其质量浓度为60 μg/mL时，细胞增殖率均低于50%；酪氨酸酶活性分别比对照组降低了26.67%、27.27%和 32.71%；黑色素生成抑制率均在 30%以上，且GCG的作用效果最明显，ECG的效果其次。与熊果苷相比较，相同浓度条件下茶叶提取物对黑色素的抑制作用更明显。低浓度条件下茶叶提取物对B16细胞几乎不存在细胞毒性，对黑色素生成的抑制作用与较高浓度熊果苷的抑制作用相当，表明茶叶提取物EGCG、GCG、ECG对黑色素的抑制作用优于已被普遍认可的美白添加剂熊果苷的抑制作用。

茶叶中的主要成分是儿茶素类物质。儿茶素能有效清除人体自由基，抑制过氧化物，起到祛斑、防晒及抗皮肤色素沉着的作用[16]。本研究中，茶叶提取物EGCG、GCG和ECG对B16小鼠黑色素瘤细胞的形态、细胞增殖率、细胞内酪氨酸酶活性以及黑色素的生成量均有一定的抑制作用，表明EGCG、GCG和ECG通过影响B16细胞的正常形态、抑制细胞增殖、抑制酪氨酸酶活性以及降低黑色素生成量等多途径发挥美白功效。

绿茶提取物是一种强烈的酪氨酸酶抑制剂，主要活性成分为GCG、ECG和EGCG。没食子酰基是这 3个儿茶素单体的活性位点[17]。GCG是酪氨酸酶竞争型抑制剂[18]。本研究中，GCG对酪氨酸酶活性的抑制作用优于EGCG的作用，推测GCG没食子酸基团的反式结构可能有利于其美白功效的发挥。

对于生产企业来说，添加茶叶提取物的成本比添加熊果苷的生产成本低，因此，茶叶提取物EGCG、GCG和ECG是一种理想的美白添加剂。

[1] 程树军，步犁，潘芳．基于黑色素形成机制的美白化妆品功效体外检测方法[J]．中国卫生检验杂志，2012(3)：259-262．

[2] 步犁，程树军，马来记．黑色素形成分子调控及美白剂功效评价方法[J]．华南国防医学杂志，2012，26(4)：395-398．DOI：10.3969/j.issn.1009-2595.2012.04.037．

[3] 王白强．皮肤黑素成因分析与美白祛斑功效评价体系的研究[J]．化学工程与装备，2008(2)：14-18．DOI：10.3969/j.issn.1003-0735.2008.02.005．

[4] 王颖异，郭宝林，张立军．具美白祛斑活性植物成分的研究进展[J]．中草药，2009，40(11)：5-9．DOI：10.3321/j.issn：0253-2670.2009.11.051．

[5] CHANG T S，CHIA-HSIANG LIN V．Melanogenesis inhibitory activity of two generic drugs：cinnarizine and trazodone in mouse B16 melanoma cells[J]. International Journal of Molecular Sciences，2011(12)：8787-8796，DOI：10.3390/ijms12128787．

[6] JAE Kyung NO，DO YU SOUNG，YOU JUNG Kim，et al．Inhibition of tyrosinase by green tea components[J].Life Sciences，1999，65(21)：241-246．

[7] 吴晓慧，周洁，王峥，等．美白祛斑化妆品的功效评价与展望[J]．香料香精化妆品，2007(3)：33-36．DOI：10.3969/j.issn.1000-4475.2007.03.009．

[8] 刘锦梅，王艳丽，潘维．4种茶叶醇提物对酪氨酸酶的抑制作用[J]．现代食品科技，2009，25(6)：610-611，616．DOI：10.3969/j.issn.1673-9078.2009.06.009．

[9] 陈贞纯，贾玲燕，毛祖法，等．茶叶提取物对B16小鼠黑色素瘤细胞的生物学效应及机理研究[J]．茶叶科学，2014，34(5)：465-472．DOI：10.3969/j.issn.1000-369X.2014.05.007．

[10] 曾亮，马梦君，官兴丽，等．茶叶提取物EGCG对B16小鼠黑素瘤细胞的影响[J]．西南大学学报(自然科学版)，2014，36(2)：171-177．

[11] 张玮，高静，张敏，等．7种美白化合物对皮肤黑素细胞的体外生物学效应[J]．药学实践杂志，2011，29(1)：24-26，40．DOI：10.3969/j.issn.1006-0111.2011.01.008．

[12] MALLICK S，SINGH S K，SARKAR C，et al，Human placental lipid induces melanogenesis by increasing the expression of tyrosinase and its related proteins in vitro[J]．Pigment Cell Res，2005，18(1)：25-33．DOI：10.1111/j.1600-0749.2004.00193.x．

[13] 程东庆，尉晓冬，王遂泉．复方中药对小鼠B-16黑素瘤细胞株黑素合成和酪氨酸酶的激活作用[J]．中华皮肤科杂志，2000，33(3)：173．DOI：10.3760/j.issn：0412-4030.2000.03.011．

[14] 宋康康．抑制剂对酪氨酸酶的效应及其对黑色素生成调控的研究[D]．厦门：厦门大学，2007．10.7666/d.y1345379．

[15] AOKI Y，TANIGAWA T，ABE H，et al．Melanogenesis inhibition by an oolong tea extract in b16 mouse melanoma cells and UV-induced skin pigmentation in brownish guinea pigs[J]．Biosci Biotechnol Biochem，2007，71(8)：1879-1885．DOI：10.1271/bbb.70099．

[16] 刘超，陈若芸．儿茶素及其类似物的化学和生物活性研究进展[J]．中国中药杂志，2004，29(10)：1017-1021.DOI：10.3321/j.issn：1001-5302.2004.10.036．

[17] NO J K，SOUNG D Y，KIM Y J，et al，Inhibition of tyrosinase by green tea components[J]．Life Sci，1999，65(21)：241-246．DOI：10.1016/s0024-3205(99)00492-0．

[18] 官兴丽，罗理勇，曾亮．天然产物的美白作用及其机理研究进展[J]．食品工业科技，2011，32(5)：432-435，439．

责任编辑：王赛群

英文编辑：王 库

Inhibitory effects of tea extracts EGCG，GCG and ECG on the melanogenesis in melanoma cell B16

ZHANG Xiangna1,2,3，LIN Yong1,2,3*，HUANG Jianan1,2,3*，LIU Zhonghua1,2,3，LIANG Dandan3
(1.National Research Center of Plant Functional Composition Utilization, Changsha 410128, China; 2.Hunan Co-Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 3.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Inhibitory effects of tea extracts EGCG, GCG and ECG on melanoma cell B16 from mouse were studied in this paper. Cells were treated with different concentrations of GCG, ECG, EGCG and Arbutin, and their morphology was observed in an inverted microscope. The proliferation rate of B16 was determined using MTT method, tyrosinase activity was detected by using L-DOPA as substrate, and NaOH-lysis approach was employed to measure the melanin synthesis.The results showed that EGCG, ECG, GCG could significantly inhibit the melanogenesis and tyrosinase activity in cells B16 with a dose-dependent manner. The proliferation rate would be lower than 50% when the concentration was increased to 60 µg/mL. Compared with the control group, tyrosinase activities affected by the three substances were reduced by 26.67%, 27.27% and 32.71%, respectively, the melanin inhibition rates were all above 30%. In conclusion, tea extracts could efficiently inhibit melanogenesis. The inhibitory effect of GCG was best, followed by ECG, EGCG, and arbutin in turn.

tea extracts; epigallocatechin gallate (EGCG); galllocatechingallate(GCG); epicatechingallate(ECG); B16melanoma cell; melanogenesis; tyrosinase

Q946.84+1

A

1007-1032(2017)04-0405-06

2016-08-16

2017-05-11

国家自然科学基金项目(31100502)；国家现代农业茶叶产业技术体系项目(CARS-23)

张向娜(1991—)，女，河南洛阳人，硕士研究生，主要从事茶叶加工及功能成分化学研究；*通信作者，黄建安，教授，主要从事茶叶审评与品质化学研究，jian7513@sina.com；*通信作者，林勇，副教授，主要从事茶叶功能成分化学研究，ly2005306@163.com。