UPLC法测定马甲子药材中马甲子素和messagenic acid B

谢 莹， 卢辛未， 谭 镭， 詹 雁， 阮 佳， 徐超群

（1.成都中医药大学，四川 成都 610075；2.四川省中医药科学院，四川 成都 610041）

UPLC法测定马甲子药材中马甲子素和messagenic acid B

谢 莹1，2， 卢辛未1，2， 谭 镭2， 詹 雁2， 阮 佳2， 徐超群2

（1.成都中医药大学，四川 成都 610075；2.四川省中医药科学院，四川 成都 610041）

建立UPLC同时测定马甲子药材中马甲子素和messagenic acid B 2种抗肿瘤活性成分的方法。采用Waters ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1mm×50mm，1.7μm）色谱柱，乙腈-0.1%甲酸溶液流动相梯度洗脱；流量：0.45mL/min；柱温30℃；检测波长320nm。结果表明：马甲子素和messagenic acid B分别在0.1986～3.972μg，0.1514～3.028 μg范围进样量与峰面积呈现良好的线性关系，平均加标回收率分别为99.20%（RSD=1.34%）和99.69%（RSD=0.56%）。该方法能在3.5min内使马甲子素和messagenic acid B最大程度地分离，相比较HPLC而言，更加快捷、高效。

马甲子；messagenic acid B；超高效液相色谱；抗肿瘤活性

0 引 言

马甲子（Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir）为鼠李科马甲子属植物，主要含有三萜类、总黄酮和环肽生物碱等成分，具有治疗疮痈溃疡，解毒消肿的功效[1]。本课题组经前期实验研究，从马甲子叶中分离出一种新型的五环三萜类化合物，结构鉴定并命名为马甲子素。体外细胞实验显示，相比于马甲子叶中抗肿瘤活性成分白桦脂酸[2-3]，马甲子素的抗肿瘤活性更强[4]。单独的马甲子素含量的HPLC测定方法已见报道[5-6]。通过对马甲子化学成分的进一步研究，从马甲子叶中首次分离出一种化合物单体，经鉴定为已知化合物messagenic acid B[7-8]，与马甲子素仅存在单双取代基的差异，均属于以白桦脂酸为母核的五环三萜类衍生物，体外细胞实验也表现出较好的抗肿瘤活性[9]。本文通过建立超高效液相色谱（UPLC）含量测定方法[10]，在10 min内完成一次马甲子样品分析。此方法分离度好，重复性高，能同时测定马甲子药材中两种活性成分，可较为全面地控制有效成分的含量，为马甲子药材的质量控制和合理种植、采收提供科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器和试药

Waters ACQUITY超高效液相色谱，包括四元高压梯度泵、自动进样恒温样品管理器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower 3色谱工作站。

乙腈（色谱纯，美国Sigma）；超纯水；甲酸、甲醇均为分析纯（成都艾科达化学试剂有限公司）。

马甲子素对照品和messagenic acid B对照品（成都普思生物科技股份有限公司，经峰面积归一法计算，纯度均大于98%）；马甲子鲜叶采于四川省成都市新津牧马山，经四川省中医药科学院鉴定为鼠李科马甲子属多年生木本植物马甲子Paliurus ramosissmus（Lour.）Poir。

1.2 方法与结果

1.2.1 样品的配置

分别精密称取马甲子素和messagenic acid B对照品1.986mg、1.514mg，用甲醇超声溶解并定容至10mL，即得各自对照品溶液。精密吸取各自对照品溶液2.5mL至10mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，混合均匀，作混合对照品溶液。

精密称取经冷冻干燥后的马甲子叶粉末5.0 g（过4号筛），置具塞三角瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，称定质量，80℃加热回流提取3 h，取出冷却后，补足减失质量，摇匀过滤，取续滤液作为供试品溶液。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相 A：乙腈；流动相B：0.1%甲酸溶液；梯度洗脱程序如表1所示，流量：0.45mL/min；柱温：30℃；检测波长：320 nm；进样量：4 μL；混合对照品和马甲子供试品的色谱图分别见图 1（a）和图 1（b）。

1.2.3 线性关系

表1 UPLC线性梯度洗脱程序

图1 混合对照品和供试品溶液的UPLC图谱

分别精密吸取马甲子素和messagenic acid B对照品溶液，按 1，2，4，8，15，20 μL 的进样量，以 1.2.2色谱条件进行检测。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线（见图2），分别计算线性回归方程：y（马甲子素）=8×106x+36 725（r2=0.999 8）；y（messagenic acid B）=9×106x+51485（r2=0.9999）。 表明马甲子素对照品和messagenic acid B对照品分别在 0.1986～3.972μg，0.1514～3.028μg范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

1.2.4 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液4μL，连续进样5次，测定马甲子素和messagenic acid B峰面积的RSD分别为1.48%和1.35%，表明仪器精密度较好，具体数据如表2所示。

图2 马甲子素和messagenic acid B的标准曲线

表2 精密度试验结果

1.2.5 重复性试验

精密称取同一批次的马甲子叶粉末5份（过4号筛），按1.2.1方法制得供试品溶液，进样4μL，测定马甲子素和messagenic acid B的含量，其RSD分别为1.93%和0.93%，表明本方法具有较好的重复性，具体数据如表3所示。

1.2.6 稳定性试验

精密称取等量同一批次的马甲子叶粉末（过4号筛），按1.2.1方法制得供试品溶液，分别在2，4，8，10，12，24h进样 4μL， 测定马甲子素和 messagenic acid B的含量，其RSD分别为0.87%和1.20%（如表4所示）。结果表明，供试品溶液在24h内稳定。

表3 重复性试验结果

表4 稳定性试验结果

1.2.7 加标回收率试验

精密称取5份同一批次马甲子叶粉末均2.5 g（过4号筛），分别测定含量后，精密加入混合对照品适量，按1.2.1方法制得供试品溶液，进样4μL，计算平均回收率，结果如表5所示，表明回收率较好。

1.2.8 样品测定

取10批等量的马甲子叶粉末（过4号筛），分别按照1.2.1方法制得供试品溶液，进样4μL，在本文所述色谱条件下，进行含量测定，结果见表6。

表5 加标回收率测定结果

表6 样品含量测定结果

2 结束语

目前对马甲子研究处于物质基础研究和初步药效学阶段，messagenic acid B是首次从马甲子叶中分离得到的具有较好抗肿瘤活性的白桦脂酸类衍生物，将该成分与马甲子素共同作为活性指标成分是一种相对比较为合理的质量评价依据。单个的马甲子素HPLC含量测定方法已被报道，其完成一次样品分析时间至少要40min。采用UPLC对马甲子进行含量测定未见文献报道，本文方法大幅缩短了含测定时间，分离度较高，峰型完整，同时检测2种活性成分的含量，可较为全面地控制马甲子药材中活性成分的动态变化。从样品UPLC图谱发现，messagenic acid B附近有两个较为独立的色谱峰（图1（b）所示供试品中3号峰和4号峰），根据峰位与峰型推测，其结构可能与马甲子素非常相近，计划对其进行进一步研究。

[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].5版.上海：上海科学技术出版社，1999：242.

[2]王开祥，张慧，郑克岩，等.白桦脂酸体外抗肿瘤的活性和机制[J].吉林大学学报，2009，47（3）：622-627.

[3]李万华，李琴，王小刚，等.皂角刺中5个白桦脂酸型三萜抗 HIV 活性研究[J].西北大学学报，2007，37（3）：40l-403.

[4]武蕊娟，宋联强，谭镭，等.马甲子的化学成分研究[J].中草药，2015，46（19）：2834-2838.

[5]赵玉丹，李双君，张桃，等.马甲子果水提物中几类物质含量的测定和DPPHo活性的清除 [J].广州化工，2015，43（23）：156-158.

[6]宋联强，武蕊娟，谭镭，等.HPLC测定马甲子药材中马甲子 1#的含量[J].中国测试，2015，41（4）：43-45.

[7]SUKSAMRARN A，TANACHATCHAIRATANA T，KANOKMEDHAKUL S，et al.Antiplasmodial triterpenes from twigs of Gardenia saxatilis[J].Journal of Ethnopharmacology，2003（88）：275-277.

[8]GARCIA-CORTEZ D A，YOUNG M C M，MARSTON A，et al.Xanthones，triterpenes and a biphenyl from Kielm eyera coriacea[J].Phytochemistry，1998，47（7）：1367-1374.

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[10]崔思娇，罗洁，张靓琦，等.UPLC同时测定酸枣仁中4种活性成分的含量[J].世界科学技术-中医药现代化，2013，15（6）：1323-1328.

（编辑：莫婕）

UPLC determination of paliurusene and messagenic acid B content in Paliurus ramosissimus leaves

XIE Ying1，2，LU Xinwei1，2，TAN Lei2，ZHAN Yan2，RUAN Jia2，XU Chaoqun2
（1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China；2.Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu 610041，China）

A UPLC method was established for simultaneous determination of two antitumor active ingredients（paliurusene and messagenic acid B） in paliurus ramosissmus.A Waters ACQUITY UPLC BEH-C18 （2.1 mm×50 mm，1.7 μm） column with acetonitrile-0.1%methanoic acid as a mobile phase was adopted for gradient elution at the flow rate of 0.45 mL/min，the column temperature was 30℃ and the detection wavelength was 320 nm.The results showed that two active ingredients （paliurusene and messagenic acid B）had a good linearity relationship between the sample content and peak area within the selected concentration range（0.198 6-3.972 μg，0.151 4-3.028μg）.The average sample recovery rate was 99.20%（RSD=1.34%） and 99.69%（RSD=0.56%）respectively.Two active ingredientsachieved the greatestdegree ofseparation in 3.5 min.Compared with HPLC，this method was much faster and more efficient.

Paliurus ramosissmus；messagenic acid B；UPLC；antitumor activity

A

1674-5124（2017）04-0048-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.04.011

2016-08-23；

2016-10-18

四川省科技支撑计划项目（15ZC1978）；四川省科研院所科技成果转化资金项目（14010139）

谢 莹（1992-），女，陕西咸阳市人，硕士研究生，专业方向为药剂学。