肝细胞癌患者CNTN1检测的临床意义

赵冀，周超，李宏敏

（四川省人民医院 1.器官移植中心，2.消化内科，3.肿瘤科，四川 成都 610072）

肝细胞癌患者CNTN1检测的临床意义

赵冀1，周超2，李宏敏3

（四川省人民医院 1.器官移植中心，2.消化内科，3.肿瘤科，四川 成都 610072）

目的 检测肝细胞癌（HCC）患者肿瘤组织中接触蛋白1（CNTN1）的表达水平，及其对患者疾病预后价值的分析。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot检测25例新鲜HCC样本，以及邻近非肿瘤组织中CNTN1 mRNA和蛋白的表达，同时采用免疫组织化学法检测135例石蜡包埋HCC样本与邻近非肿瘤组织中CNTN1的蛋白表达，统计分析其表达与HCC患者临床病理特征的关系，采用RNAi技术干扰肝癌细胞系HepG2 CNTN1的表达，对其进行肿瘤细胞侵袭和转移能力检测。结果25例新鲜HCC样本qRT-PCR和Western blot检测结果表明，与邻近非肿瘤组织相比，HCC组织中CNTN1 mRNA和蛋白表达均上调（P＜0.05）。免疫组织化学法结果证实62.22%（84/135）HCC样本为CNTN1阳性，高于邻近非肿瘤组织17.78%（24/135）（P＜0.05）。Kaplan–Meier生存分析表明，CNTN1阳性HCC患者无疾病生存率和总生存率低于阴性患者。CNTN1表达与HCC患者肿瘤转移、乙型肝炎病毒感染、淋巴结肿瘤转移分期及肿瘤直径相关（P＜0.05）。RNAi实验表明，干扰CNTN1表达后HepG2细胞活力下降（P＜0.05）。多重变量分析表明，CNTN1表达是HCC患者无疾病生存期和总生存期的独立标志物（P＜0.05）。结论HCC患者肿瘤组织中CNTN1蛋白表达上调，且其表达与肿瘤恶性状态密切相关，参与肝细胞癌的侵袭和转移，可以作为HCC患者疾病预后的独立标志物。

接触蛋白1；肝细胞癌；预后；生物标志物

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在全球常发恶性肿瘤中排第5位，在肿瘤病死率排第3位[1]。我国乙肝患者数量较多，导致肝细胞癌高发[2]。术后复发和肿瘤转移是导致HCC患者疾病预后不良的主要因素[3]。接触蛋白 1（contactin 1，CNTN1）是免疫球蛋白超家族成员，属于糖基磷脂酰肌醇锚定的神经细胞黏附分子。报道表明，CNTN1在胃癌、肺癌等恶性肿瘤中表达上调，且与上述肿瘤患者疾病发展、侵袭及转移密切相关[4-6]。目前CNTN1在肝细胞癌中研究报道较少，本研究旨在检测HCC组织中CNTN1的表达水平及其对患者疾病预后价值的分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年1月-2012年12月四川省人民医院收治的135例肝细胞癌患者，取其石蜡样本及相应的临近非肿瘤组织样本（距离肿瘤组织＞2 cm）。25例新鲜样本采集后液氮浸泡，分别用于提取总RNA和蛋白。本研究纳入患者均通过病理检查确诊，临床样本采集及后续研究均获得患者同意和本院医学伦理审查。通过病历获取患者一般资料。

1.2 细胞及RNAi实验

人肝癌细胞（human hepatocellular carcinoma cell，HepG2）购自美国模式培养物保藏所，常规方法培养[7]。分为正常组与RNAi组，RNAi组干扰前将HepG2按2×105个/孔，铺6孔板，换无血清改良培养基，细胞汇合度达40%时进行干扰。根据Lipofectamine说明书将siRNA duplex-Lipofectamine RNAi MAX加入培养基。孵育4 h后，换成含10%胎牛血清培养基，干扰后测定细胞活力。CNTN1靶标siRNA和阴性对照siRNA购自上海基因治疗有限公司。siRNA正向引物：5'-GAUGGAAAGUGAGGAAGACAGUAAU-3'，反向引物：5'-AUUACUGUCU UCCUCACUUUCCAUC-3'；阴性对照RNA正向引物：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'， 反 向引物：5'-AUUACUGUCUUCCUCACUUUCCAUC-3'。

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应

采用Trizol方法提取组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度和浓度后，取2 μg进行逆转录，生成cDNA。采用SYBR green染料法进行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 检测，CNTN1 正向引物：5'-CCTAGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3'，反向引物：5'-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3'。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因为内参，GAPDH 正向引物：5'-CCTAGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3'，反向引 物 ：5'-GCCAGTAGA GGCAGGGATGATGTTC-3'。扩增条件及计算方法参考文献[8]。

1.4 Western blot检测

常规方法提取组织总蛋白，二喹啉甲酸方法测定蛋白质含量后，进行凝胶电泳，上样20μg/孔，电转至聚偏氟乙烯薄膜上后，3%脱脂奶封闭2 h，分布孵育抗人CNTN1和GAPDH一抗，4℃孵育过夜，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）洗膜，孵育二抗后显影。采用Quantity one软件对条带亮度进行分析。

1.5 免疫组织化学法

采用常规方法制备5 μm厚的石蜡切片，进行免疫组织化学法染色，在10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）热激30 min介导抗原复性，采用抗CNTN1单克隆抗体孵育，4℃过夜。洗涤后孵育二抗，加显色液后进行曝光。根据染色强度进行判定，总分0～3分，0分为无染色，1分为弱染色，2分为中度染色，3分为强染色。

1.6 细胞活力检测

取1.2中干扰后的HepG2细胞和HepG2细胞，按1×103个/孔接种于96孔板，培养至细胞密度为60%时，换为无血清的达尔伯克必需基本培养基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM），分别培养8、24、48和 72 h后，按照 Presto blue cell viability rgnt试剂盒（南京科佰生物科技有限公司）加入Presto Blue试剂，二氧化碳CO2培养箱37℃孵育10 min，取出96孔板酶标仪进行检测。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用独立t检验或重复测量设计的方差分析；计数资料以率表示，用χ2检验；总生产率与无疾病生存率的评估用Kaplan-Meier检验，两组生存曲线的比较用Log-rank检验，多重变量分析用Cox比例危险模型进行，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常组与RNAi组不同时间细胞活力的比较

正常组与RNAi组在8、24、48和72 h细胞活力比较，采用重复测量数据的方差分析，结果：①不同时间细胞活力比较，差异有统计学意义（F=17.841，P=0.000）；②正常组与RNAi组细胞活力比较，差异有统计学意义（除8 h时间）（F=91.561，P=0.000）。③正常组和RNAi组细胞活力变化趋势有差异（F=15.215，P=0.000）。见表 1 和图 1。

2.2 CNTN1 mRNA和蛋白的比较

图1 HepG2细胞活力

采用qRT-PCR检测25对肝细胞癌样本和临近非肿瘤组织样本，肝细胞癌CNTN1 mRNA表达量为（7.22±1.85），与非肿瘤组织（2.81±1.42）比较，差异有统计学意义 （t=0.236，P=0.003）；Western blot检测结果表明，肝细胞癌CNTN1蛋白表达量为（1.32±0.61），与非肿瘤组织（0.83±0.50）比较，差异有统计学意义（t=0.416，P=0.003），肝细胞癌高于与非肿瘤组织。见图2、3。

表1 两组不同时间细胞活力比较 （±s）

表1 两组不同时间细胞活力比较 （±s）

注：†与正常组比较，P＜0.05

组别72 h正常组 470.00±13.64 820.00±23.64 1320.00±39.69 2120.00±43.64 RNAi组 468.00±13.89 482.00±25.67† 760.00±30.64† 96.00±33.56†8 h 24 h 48 h

图2 CNTN1 mRNA和蛋白的表达

2.3 CNTN1表达与HCC患者临床病理特征的关系

采用免疫组织化学法检测135例HCC样本CNTN1蛋白的表达，62.22%（84/135）HCC 样本为CNTN1阳性，高于临近非肿瘤组织的17.78%（24/135）（χ2=55.556，P=0.005）。CNTN1 表达与 HCC 患者肿瘤转移、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染、肿瘤淋巴结转移（tumor node metastasis，TNM）分期及肿瘤直径相关（P＜0.05）。见表2和图4。

2.4 CNTN1表达与HCC患者疾病预后的关系

图3 CNTN1蛋白的表达

表2 患者临床病理特征与HCC样本CNTN1表达的关系

图4 HCC样本中CNTN1的表达（免疫组织化学法×400）

为进一步探讨HCC样本中CNTN1表达与患者疾病预后的关系，采用Kaplan-Meier生存曲线分析其表达与患者随访总生存率及无疾病生存期的关系。CNTN1阳性HCC患者的总生存期（19.96±9.39）个月低于阴性患者[（31.27±11.45）个月]（P=0.006）。此外CNTN1阳性HCC患者的无疾病生存期（13.61±8.63）个月低于阴性患者[（24.51±10.41）个月]（P=0.003）。多重变量分析表明，CNTN1表达是HCC 患者总生存期[HR=2.383（95%CI：1.262，4.503）P=0.003]和无疾病生存期[HR=2.356（95%CI：1.370，4.049）P=0.003]的独立预后因素。见图5。

图5 HCC患者CNTN1表达的Kaplan-Meier生存曲线分析

3 讨论

CNTN1与多种细胞表面蛋白相互作用，可能参与多种细胞表面信号转导[9]，其作为神经系统黏附分子，也参与肿瘤细胞的血管内皮生长因子C/血管内皮生长因子受体3信号通路。研究表明，CNTN1参与多种肿瘤细胞的侵袭和转移调节，CNTN1基因敲除后能导致肺腺癌细胞转移抑制，增加负瘤小鼠的存活率[10]。CNTN1的肿瘤调节作用在多数人类恶性肿瘤中均有报道，而其在肝细胞癌发生、发展中的作用研究较少。

本研究表明，HCC样本中CNTN1 mRNA和蛋白表达均上调。RNAi实验表明，HepG2细胞在干扰CNTN1表达后，细胞活力下降。本实验结果表明，CNTN1表达上调与HCC患者肿瘤转移、HBV感染、TNM分期及肿瘤直径相关。此外，免疫组织化学法染色证实CNTN1阳性患者的总生存率和无疾病生存率低于CNTN1阴性患者，CNTN1表达是HCC患者疾病预后不良独立标志物。

尽管文献和本研究数据均证实CNTN1能促进肿瘤细胞侵袭和转移，但是其中的调节机制目前尚不清楚，笔者推测CNTN1可能通过激活Akt途径促进HCC发展。YAN等[6]采用A549细胞证实，CNTN1能使E-钙黏着糖蛋白表达下调，且Akt激活在CNTN1下调E-钙黏着糖蛋白表达过程中发挥重要作用。现有研究表明，HCC肿瘤中PI3K-Akt-mTOR信号途径异常[11-13]。ZHOU等[14]研究表明，上述通路异常常导致HCC患者疾病预后不良。

本研究结果证实，HCC患者肿瘤组织中CNTN1蛋白表达上调，且其表达与肿瘤恶性状态相关，参与肝细胞癌的侵袭和转移，可以作为HCC患者疾病预后的独立标志物。

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（童颖丹 编辑）

Feasibility of contactin 1 as a novel prognostic marker for hepatocellular carcinoma

Ji Zhao1,Chao Zhou2,Hong-min Li3
(1.Organ Transplantion Center;2.Department of Gastroenterology;3.Department of Oncology,Sichuan Provincial People's Hospital,Chengdu,Sichuan 610072,China)

ObjectiveTo evaluate the feasibility of contactin 1 (CNTN1)as a novel prognostic marker for epithelial hepatocellular carcinoma.MethodsqRT-PCR and Western blot were performed to assess the mRNA and protein levels of CNTN1 in 25 matched fresh HCC specimens.The clinical and prognostic significance of CNTN1 in 135 cases of HCC was determined by immunohistochemistry.The correlations between CNTN1 expression and clinicopathological characteristics were analyzed.The expression of CNTN1 in HepG2 cells was interfered by RNAi technique,then the invasive and metastatic abilities of the HepG2 cells were determined.ResultsCNTN1 expression in the fresh HCC tissues was higher than that in the paracancerous tissues at both mRNA and protein levels(P＜0.05).Notably,immunohistochemical results revealed that CNTN1 expression significantly increased in the HCC compared to the adjacent tissues (62.22%vs 17.78%,P＜0.05).The vitality of HepG2 cells was significantly decreased after RNA interference (P＜0.05).Furthermore,positive CNTN1 expression was associated with tumor size,HBV infection,metastasis,and tumor-node-metastasis stage (P＜0.05).Kaplan-Meier survival analysis showed that high CNTN1 was correlated with reduced overall survival(OS)rate(P＜0.05)and disease-free survival(DFS)rate(P＜0.05).Multivariate analysis identified CNTN1 as an independent poor prognostic factor of OS and DFS in HCC patients (P＜0.05).ConclusionsOur resultssuggest that CNTN1 expression is up-regulated in HCC and closely correlated with the invasion and metastasis of HCC.It can be served as an independent unfavorable prognostic marker for HCC.

contactin 1;hepatocellular carcinoma;prognosis,biomarker

R735.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.010

1005-8982（2017）12-0050-05

2016-06-29