膀胱尿路上皮癌中PTEN表达与其基因甲基化的关系*

尹永华，程文杰，延敏博

（1.广州医科大学附属深圳沙井医院 泌尿外科，广东 深圳 518104；2.中山大学附属第五医院 泌尿外科，广东 珠海 519000）

临床研究·论著

膀胱尿路上皮癌中PTEN表达与其基因甲基化的关系*

尹永华1，程文杰2，延敏博2

（1.广州医科大学附属深圳沙井医院 泌尿外科，广东 深圳 518104；2.中山大学附属第五医院 泌尿外科，广东 珠海 519000）

目的 探讨膀胱尿路上皮癌（BUCC）中第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因（PTEN）表达与其基因启动子甲基化的关系。方法应用Western blot、甲基化特异性聚合酶链反应（MSP），检测41例BUCC和18例正常膀胱组织中PTEN蛋白的表达水平及其基因启动子甲基化状态，并分析两者的相关性。结果

BUCC中PTEN蛋白表达低于正常膀胱组织（P＜0.05），而BUCC中PTEN基因启动子甲基化率为53.66%（22/41），高于正常膀胱组织的0.00%（0/18）（P＜0.05）；与甲基化阴性组的BUCC组织相比，22例甲基化阳性组的PTEN表达水平降低（P＜0.05）。结论BUCC中PTEN蛋白的表达水平下调，这与其基因启动子高甲基化密切相关。

膀胱尿路上皮癌；磷酸酶-张力蛋白基因；DNA甲基化

膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial cell carcinoma，BUCC）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。近期研究发现，DNA甲基化导致的基因沉默或者低表达可能与其发生、发展有关[1]。第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）是第1个最早发现的具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，其编码产物可以使PIP3在D3位去磷酸化生成PIP2，从而诱导细胞凋亡及细胞周期的阻滞，防止肿瘤的发生[2]。PTEN基因在多种恶性肿瘤中存在表达缺失或低表达，其中大部分与该基因启动子甲基化有关[3]，而在膀胱尿路上皮癌中相关的研究较少。本文应用Western blot、甲基化特异性聚合酶链反应（methylation specific polymerase chain reaction，MSP）检测膀胱尿路上皮癌中PTEN基因的表达水平及其启动子甲基化状态，并分析两者的关系，为揭示膀胱癌发生的分子生物学机制提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2014年3月-2015年11月在中山大学附属第五医院就诊的膀胱尿路上皮癌患者手术标本41例。其中，男性29例，女性12例；平均年龄59.5（35～81）岁；临床分期：非肌层浸润性（Tis Ta、T1）26例，肌层浸润性（T2～T4）15例；病理分级：Ⅰ级 14例，Ⅱ级16例，Ⅲ级11例；有淋巴结转移11例，无淋巴结转移30例；另取同期正常膀胱组织标本18例作为对照组，两组性别和年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。以上标本均经病理组织学检查证实，标本离体后立即置液氮冷冻，而后置入-80℃冰箱中冷冻保存。在与患者沟通并征得其同意的情况下收集所有标本，符合本院医学伦理委员会的要求。

1.2 实验试剂与仪器

兔抗人PTEN单克隆抗体及HRP标记的羊抗兔抗体购自广州齐云生物有限公司，动物组织DNA试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，EZ DNA Methylation-GoldTMKit试剂盒购自美国Zymo Research公司，引物合成由上海生工生物工程有限公司提供，紫外分光光度仪计购自美国贝克曼公司（型号：DU800），酶标仪MK3购自芬兰Thermo labsystems公司，PTC-220-聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪购自美国 Zymo Research公司，2020D紫外荧光数字成像仪（日本岛津公司）。

1.3 Western blot检测

取-80℃保存的新鲜膀胱尿路上皮癌组织及正常膀胱组织，提取总蛋白并检测其浓度。每孔上样量为30μg，电泳、转膜，含10%脱脂奶粉封闭液中封闭2 h；在装有稀释好的一抗工作液的杂交袋中过夜，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗膜5次，15 min/次；加二抗于室温孵育2 h，将其置于暗室，取医用X线底片覆盖，曝光1 min后，依次显影、定影；并予Image-Pro Plus软件进行灰度分析。

1.4 MSP法

使用动物组织DNA试剂盒从膀胱尿路上皮癌和正常组织中提取基因组DNA，紫外分光光度计检测DNA含量和纯度，予EZ DNA Methylation-GoldTMKit试剂盒进行亚硫酸氢盐修饰并纯化，置于-20℃冷冻保存备用。

利用Methprimer软件进行设计，并由上海生工生物工程有限公司合成。甲基化正向引物：5'-GTAT TTCGAGTAAAGGAAGAAGACG-3'，反向引物：5'-G ATAAAAAACTACAACCCAACGAA-3'；非甲基化正向引物：5'-TATTTTGAGTAAAGGAAGAAGATGA-3'，反向引物：5'-CAATAAAAAACTACAACCCAACAAA-3'；扩增产物长度均为200 bp；PCR反应体系为50μl，含 500 ng/μl模板 DNA 1 μl，10×LA PCRTMBuffer（Mg2+plus）5μl，dNTP Mixture 8μl，20μmol/L正反向特异性引物各 0.5 μl，ddH2O 34.5 μl，日本TaKaRa LA TaqTM0.5 μl。循环参数：95℃预变性5 min，94℃变性 45 s，55℃退火 30 s，74℃延伸 30 s，共循环30次，74℃继续延伸10 min。取PCR反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳，以ddH2O作空白对照，电压100V，30 min后在紫外灯下观察结果并照相。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计软件，计数资料以率或百分比表示，用χ2检验，两变量非配对比较用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTEN蛋白的表达

用Western blot定量检测膀胱尿路上皮癌组织和正常膀胱组织中PTEN的表达，并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）表达为内参蛋白。两组PTEN蛋白表达比较，经秩和检验，差异有统计学意义（Z=5.350，P=0.000），PTEN表达水平在膀胱尿路上皮癌组织中低于正常膀胱组织。见图1。

图1 膀胱尿路上皮癌和正常膀胱组织中PTEN蛋白的表达

2.2 PTEN基因启动子甲基化状态

41例膀胱尿路上皮癌标本中，22例标本中的PTEN基因启动子区发生甲基化（出现甲基化条带），其PTEN基因启动子区发生甲基化阳性率为53.66%（22/41），而18例正常膀胱组织标本均未发生甲基化（只有非甲基化条带），其PTEN基因启动子区发生甲基化阳性率为0%（0/18），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=15.401，P=0.000），PTEN 基因启动子区发生甲基化率在膀胱尿路上皮癌组织中高于正常膀胱组织。见图2。

2.3 PTEN表达与其基因甲基化的关系

按照PTEN基因启动子甲基化状态，将41例膀胱尿路上皮细胞癌组织分为甲基化阳性组（22例）及阴性组（19例），两组PTEN表达水平比较，经秩和检验，差异有统计学意义（Z=16.751，P=0.000），启动子甲基化阳性组PTEN表达水平低于甲基化阴性组。

图2 膀胱尿路上皮癌和正常膀胱组织中PTEN基因启动子甲基化状态

3 讨论

膀胱癌是我国发病率最高的泌尿系恶性肿瘤，在西方发达国家其发病率也高居泌尿生殖系肿瘤的第2位，仅次于前列腺癌[4]，60岁以后，男性膀胱癌死亡率即超过肾肿瘤，居男性泌尿系恶性肿瘤第1位[5]。膀胱尿路上皮癌是膀胱癌中最常见的病理类型，近年来不但发病率持续上升，而且膀胱尿路上皮癌的复发率也逐渐增高[6]。

PTEN是具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，其编码产物是一种PIP3磷酸酶，通过减少PIP3生成，抑制细胞迁移，抑制血管生成等起到抗肿瘤的作用。目前发现，PTEN蛋白在多种恶性肿瘤组织中均存在表达下降，并认为PTEN基因低表达可能与其启动子甲基化有关[7]。

DNA甲基化属于表观遗传学的一种类型，其可直接干扰特异转录因子与启动子上识别位点的结合从而阻止转录因子与基因形成转录复合物，进而影响基因表达，因此，DNA甲基化与癌症的发生、发展密切相关。国内外研究者已从膀胱癌患者的标本中发现多种抑癌基因与修复基因的甲基化改变，如p14、p15、Rb、RASSFlA 等，而关于膀胱尿路上皮癌中PTEN的甲基化研究较少[8-11]。

笔者运用Western blot检测及MSP技术进行研究，对比PTEN基因表达水平及其启动子甲基化状态在膀胱尿路上皮癌和正常膀胱组织中的差异。实验结果显示，膀胱尿路上皮癌中PTEN蛋白表达低于正常膀胱组织。这与一些学者的研究结果基本相符[12-15]。41例膀胱尿路上皮癌组织中有53.66%（22/41）发生PTEN基因启动子甲基化改变，而在正常膀胱组织均未发生甲基化，两者差异有统计学意义。这证实膀胱尿路上皮癌中的确存在PTEN基因启动子的高甲基化改变。

而膀胱癌中PETN基因高甲基化原因是什么呢？目前相关研究较少，但有学者对人直肠癌细胞系进行研究发现，同时阻断DNA甲基化转移酶（DNMT1和DNMT3b）会使整个基因组甲基化水平下降＞95%，说明DNMT1和DNMT3b共同维持DNA甲基化和基因沉默[16]。该机制在PTEN基因中是否存在，有待今后进一步研究；另外，PTEN高甲基化可能还与饮食、环境及病毒感染等因素相关。

KANG[17]和HINO等[18]检测66例胃癌组织，发现其中26例启动子甲基化组织中又有73%（19/26）存在PTEN表达缺失，认为在胃癌中PTEN失活与其启动子甲基化有关。国内学者检测83例手术切除的肺癌标本组织，发现肺癌组织中PTEN基因启动子甲基化率为57.8%（48/83），明显高于癌旁组织的30.1%（25/83）；肺癌组织中的PTEN mRNA的阳性表达率为32.5%（27/83），明显低于癌旁组织的 55.4%（46/83），认为肺癌组织中PTEN基因失表达与其启动子甲基化有关，可能是肺癌发生、发展的原因之一[19]。膀胱尿路上皮癌中是否存在类似情况呢？通过分析笔者发现，与甲基化阴性组的膀胱尿路上皮癌组织相比，22例甲基化阳性组的PTEN表达水平降低。这与KANG等[17]结果相符，证实膀胱尿路上皮癌中PTEN表达降低与其启动子甲基化密切相关。

在本研究中，膀胱尿路上皮癌中PTEN基因启动子存在高甲基化改变，而且该区域高甲基化可能会下调PTEN蛋白表达水平，这可能与膀胱癌的发生、发展密切相关，这是基因甲基化与肿瘤发病相关的又一佐证，也为探讨膀胱尿路上皮癌发生机制提供新的研究方向，并为今后肿瘤基因靶向治疗提供新的靶点，有一定的临床应用价值。

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（童颖丹 编辑）

Correlation between expression ofPTENand its promoter methylation in bladder urothelial cell carcinoma*

Yong-hua Yin1,Wen-jie Cheng2,Min-bo Yan2
(1.Department of Urology,Shenzhen Shajing People's Hospital,Guangzhou Medical University,Shenzhen,Guangdong 518104,China;2.Department of Urology,the Fifth Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University,Zhuhai,Guangdong 519000,China)

ObjectiveTo investigate the relationship between expression of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten (PTEN)gene and its promoter methylation in bladder urothelial cell carcinoma(BUCC).MethodsThe protein expression and promoter methylation ofPTENgene were detected in 41 cases of BUCC and 18 normal bladder tissues using Western blot and Methylation Specific PCR (MSP)method respectively,and their correlation was analyzed.ResultsPTEN protein expression in the BUCC was lower than that in the normal bladder tissues (P＜0.05).And the promoter methylation rate ofPTENgene in the BUCC (53.66%,22/41)was significantly higher than that (0.00%,0/18)in the normal bladder tissues (P＜0.05).The expression level of PTEN protein in the BUCC of the methylation negative group was obviously lower than that of the methylation positive group(P＜0.05).ConclusionsThe low expression of PTEN protein in BUCC is closely related with the high methylation ofPTENgene promoter.

bladder urothelial cell carcinoma;phosphate and tension homology deleted on chromsome ten;DNA methylation

R737.14

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.009

1005-8982（2017）12-0046-04

2016-07-15

广东省深圳市科技计划项目（No：JCYJ20140414160300578）

程文杰，E-mail：602676045@qq.com；Tel：18613150560