长链非编码RNA PRNCR1对胃癌细胞增殖、侵袭及转移的研究

蔡毅

（南华大学附属第一医院 急诊内科，湖南 衡阳 421001）

长链非编码RNA PRNCR1对胃癌细胞增殖、侵袭及转移的研究

蔡毅

（南华大学附属第一医院 急诊内科，湖南 衡阳 421001）

目的 探索胃癌MGC-803细胞和人正常胃黏膜上皮GES-1细胞中，长链非编码RNA PRNCR1的表达，以及沉默PRNCR1对胃癌MGC-803细胞增殖、侵袭及迁移的影响。方法利用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测细胞中PRNCR1表达水平；设计并合成PRNCR1-siRNA及对照序列（PRNCR1-NC）转染胃癌细胞，通过qRT-PCR检测细胞中PRNCR1的沉默效果；利用四甲基偶氮唑盐比色法检测胃癌细胞的增殖；Transwell实验检测胃癌细胞迁移和侵袭能力的变化。结果PRNCR1在胃癌MGC-803细胞中的表达高于人正常胃黏膜上皮GES-1细胞，PRNCR1-siRNA可以下调胃癌MGC-803细胞中PRNCR1的表达，并可以抑制MGC-803细胞的增殖和侵袭转移能力。结论PRNCR1-siRNA能够下调PRNCR1的表达，并有效抑制胃癌细胞的增殖和侵袭迁移力，为以PRNCR1为靶点的胃癌基因治疗奠定理论基础。

长链非编码RNA；前列腺癌非编码RNA1；增殖；侵袭；转移；胃癌

胃癌是源自胃黏膜上皮的恶性肿瘤，占全部恶性 肿瘤的第3位，居消化道恶性肿瘤的首位，占胃恶性肿瘤的95%。早期胃癌多无症状或仅有轻微症状，当临床症状明显时，病变已属晚期。由此可见，胃癌严重威胁着人类的健康[1]。目前，胃癌的致病基因、发病机制及影响预后的因素仍不清楚，因此寻找胃癌发生、发展的致病因素具有重要意义。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类不具有蛋白质编码功能、长度＞200 nt的RNA。最新研究显示，lncRNA并非既往认为的“噪音”RNA，而是在生物进化过程中高度保守，具有重要调控功能的非编码RNA[2]。前列腺癌非编码RNA1（prostate cancer non-coding RNA 1，PRNCR1）定位于染色体8q24，长约13 kB，已经被证实在前列腺癌、结肠癌中发挥重要作用[3]。最新研究发现，PRNCR1的基因多态性与胃癌的患病风险有关[4]。但PRNCR1在胃癌中的作用尚不清楚。本实验通过探索PRNCR1在胃癌细胞和人正常胃黏膜上皮细胞中的表达，并通过RNA干涉技术沉默胃癌细胞中PRNCR1的表达，检测其对胃癌细胞增殖、侵袭及转移能力的影响，为将PRNCR1分子作为胃癌基因治疗靶点提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Trizol细胞裂解液购于北京博润莱特科技有限公司，RNA反转录试剂、实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒购自日本TaKaRa公司，细胞转染试剂购自美国Invitrogen公司，四甲基偶氮唑盐比色法[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]试剂购自美国Promega公司，细胞侵袭转移检测transwell小室购自美国Milipore公司，基质胶购自美国Sigma公司，MGC-803细胞、GES-1细胞购自上海细胞库。

1.2 方法

1.2.1 PRNCR1-siRNA的设计和合成 根据PRNCR1序列，按照siRNA作用靶点设计原则，利用美国Invitrogen公司的siRNA作用靶点设计软件，委托上海吉玛基因股份有限公司合成相应的siRNA及对照序列，分别为PRNCR1-siRNA、PRNCR1-NC。1.2.2 细胞培养和转染 MGC-803细胞、GES-1细胞用含100 ml/L胎牛血清的达尔伯克必需基本培养基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM），于37℃、50 ml/L二氧化碳CO2细胞培养箱中培养。适量MGC-803细胞接种在25mm2培养皿中，待细胞密度达70%～80%后，将合成的PRNCR1-siRNA、PRNCR1-NC经Lipofectamine 2000转染至MGC-803细胞中，具体操作按Lipofectamine 2000试剂盒说明书操作。转染后的细胞分别为PRNCR1-siRNA组和PRNCR1-NC组。

1.2.3 qRT-PCR检测PRNCR1的表达 利用qRT-PCR对PRNCR1表达进行检测。收集转染48 h后的细胞，利用Trizol细胞裂解液提取细胞，得总RNA，并反转录为cDNA。PRNCR1定量PCR引物。正向引物：5'-CCAGGGGGAAACACACAG-3'；反向引物：5'-AAATGGCAGTTTCCTTCAATG-3'。β-actin作为看家基因，正向引物：5'-TTGGCTTGACTCAGG ATTTA-3'，反向引物：5'-ATGCTATCACCTCCCCTGT G-3'。引物序列合成由深圳华大基因公司完成。反应条件：95℃预变性 4 min，95℃变性 12 s，59℃退火35s，共41个循环。每组3个复孔，实验重复3次，将所得数据绘制成柱状图。

1.2.4 MTT实验检测MGC-803细胞增殖 取转染48 h后且处于对数生长期的MGC-803细胞，常规洗涤2遍，用胰蛋白酶消化细胞，离心重悬后制成单细胞悬液，并调整细胞浓度为3×104个/ml，加入细胞悬液200 μl/孔，每组设7个复孔。共培养5个96孔板，分别培养1～5 d，检测1板/d。每天于实验结束前4 h，加入5 mg/ml MTT 20 μl/孔，放入孵箱继续培养4 h，弃上清液，加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μl/孔，震荡 11 min，使 MTT 的还原产物充分溶解，于490 nm处测定细胞的光密度（optical density，OD）值。

1.2.5 Transwell实验检测MGC-803细胞侵袭和转移能力 MGC-803细胞转染48 h后，通过Transwell实验检测细胞侵袭和转移力的变化，每组设3个复孔。胰蛋白酶消化各组细胞，无菌磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗 3遍，离心后用牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）10 g/L 无血清培养基重悬细胞，将细胞密度调整为1×105个/ml，事先用基质胶包被好Transwell小室中上室的基底膜，每组细胞悬液中取150 μl加入上室中，将小室放入24孔板中，下室中加入含有胎牛血清的培养基500 μl，培养 36 h。结束后，将小室取出，PBS 轻轻冲洗，棉签擦去小室上室内层的细胞，95%乙醇固定6 min，4 g/L结晶紫溶液染色后，倒置显微镜下计数，每样本随机选取5个视野进行计数后取平均值，绘制柱状图。检测MGC-803细胞转移能力时，小室的上室中无需基质胶包被基底膜，其他步骤与上述方法相同。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验或重复测量设计的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1PRNCR1在MGC-803细胞中高表达

收集对数生长期的MGC-803和GES-1细胞，提取细胞总RNA，qRT-PCR检测PRNCR1的表达。结果显示，经标准化后，GES-1细胞PRNCR1相对表达量为（1.000±0.051），MGC-803细胞PRNCR1相对表达量为（3.146±0.783），经t检验，差异有统计学意义（t=6.844，P=0.017），与GES-1细胞比较，PRNCR1在MGC-803细胞中高表达。见图1。

2.2 PRNCR1-siRNA下调MGC-803细胞中PRNCR1的表达

PRNCR1-siRNA及对照序列转染MGC-803细胞后48 h，抽提细胞总RNA，qRT-PCR检测其表达。结果显示，经标准化后，PRNCR1-NC组PRNCR1相对表达量为（1.000±0.153），PRNCR1-siRNA 组细胞PRNCR1相对表达量为（0.488±0.091），经 t检验，差异有统计学意义（t=7.841，P=0.009），PRNCR1-siRNA组PRNCR1表达较PRNCR1-NC组下调。见图2。

图1 细胞中PRNCR1的表达 （±s）

图2 两组细胞PRNCR1表达变化 （n=3，±s）

2.3 PRNCR1-siRNA抑制MGC-803细胞增殖

MTT实验检测PRNCR1-siRNA对MGC-803细胞增殖的影响，PRNCR1-siRNA与PRNCR1-NC组术后 24、48、72、96和 124 h测量的 OD 值比较，采用重复测量数据的方差分析，结果：①不同时间点的OD值有差异（F=8.105，P=0.014）；②PRNCR1-iRNA组与PRNCR1-NC组的OD值有差异（F=16.217，P=0.008），PRNCR1-siRNA组较PRNCR1-NC组OD值低，增殖速度较慢；③PRNCR1-siRNA组与PRNCR1-NC组的OD值变化趋势有差异（F=7.814，P=0.032），从检测后第3天开始，PRNCR1-siRNA组细胞的增殖速度较PRNCR1-NC组缓慢。见图3和附表。

2.4 PRNCR1-siRNA抑制MGC-803细胞的侵袭

图3 PRNCR1-siRNA对细胞增殖的影响

附表 两组各时间点OD值比较 （n=3，±s）

附表 两组各时间点OD值比较 （n=3，±s）

组别120 h PRNCR1-NC 组 0.481±0.100 0.863±0.090 1.501±0.121 2.407±0.104 2.901±0.201 PRNCR1-siRNA组 0.503±0.171 0.804±0.221 1.201±0.221 1.614±0.107 1.915±0.224 24 h 48 h 72 h 96 h

PRNCR1-siRNA及对照序列转染MGC-803细胞48h后，结果显示，PRNCR1-siRNA组穿过Matrigel包被的微孔膜的细胞数目为（21.635±7.424）个/高倍镜，PRNCR1-NC组穿过Matrigel包被的微孔膜的细胞数目为（52.471±9.518）个/高倍镜，经t检验，差异有统计学意义（t=10.471，P=0.025），PRNCR1-siRNA组穿过Matrigel包被的微孔膜的细胞数目少于PRNCR1-NC组。说明沉默PRNCR1表达后，可以抑制MGC-803细胞的侵袭能力。见图4。

2.5PRNCR1-siRNA抑制MGC-803细胞迁移

PRNCR1-siRNA及对照序列转染MGC-803细胞48 h后，PRNCR1-siRNA组穿过Matrigel包被的微孔膜的细胞数目为（23.534±5.176）个/高倍镜，PRNCR1-NC组穿过Matrigel包被的微孔膜的细胞数目为（41.512±8.873）个 /高倍镜，经 t检验，差异有统计学意义（t=9.214，P=0.017），PRNCR1-siRNA组穿过Matrigel包被的微孔膜的细胞数目少于PRNCR1-NC组，说明沉默PRNCR1表达后，可以抑制MGC-803细胞的迁移能力。见图5。

图4 MGC-803细胞侵袭能力的变化

图5 MGC-803细胞迁移能力的变化

3 讨论

lncRNA仅仅是RNA聚合酶Ⅱ的转录副产物，在生物体内没有任何生物学功能，但最近发现，lncRNA不仅可在多种层面上对基因的表达进行调控，而且与多种疾病的发生密切相关。目前大量相关研究证实，lncRNA的异常表达会导致其调控的下游功能基因异常表达，最终导致机体产生严重的病理变化，更有甚者诱导肿瘤的发生、发展[5]。肺腺癌转移相关转录子-1（metastasis-associated lung adenocar cinoma transcript-1，MALAT-1）是一类存在于细胞核内的长链非编码RNA。研究证实，MALAT-1的异常表达与人类多种肿瘤的发生、发展密切相关，包括宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌等，并与一些肿瘤的远处转移、术后复发及药物治疗耐药有关[6]。PRENSNER等[7]研究发现，在前列腺癌中长链非编码RNA PCGEM1过表达，PCGEM1可促进前列腺癌细胞的恶性增殖，并与患者的不良预后相关。lncRNAs可以在人的循环血液中检测到，并在肿瘤中异常表达，说明lncRNAs很可能成为肿瘤的特异性诊断标志物。有研究报道，与健康对照组血清比较，长链非编码RNA XLOC_006844、LOC152578及 XLOC_000303在结肠癌患者血清中表达升高，提示这3种lncRNAs很可能成为结肠癌诊断的新指标[8]。循环血清中的lncRNA HOTAIR可以作为乳腺癌早期诊断的生物学指标[9]。由此可见，lncRNAs在肿瘤的发生、发展中发挥着至关重要的作用。

lncRNAs在胃癌的研究中也有许多研究进展，LIU等[10]研究发现，H19通过RUNX1促进胃癌的增殖和侵袭。PANDAR的高表达预示着胃癌患者预后不良[11]。LI等[12]发现，PRNCR1的基因多态性可能是胃癌的一个致病因素。但PRNCR1在胃癌中的作用并不清楚，因此，研究其在胃癌细胞中的表达及其在胃癌发生、发展中的作用，将有助于更加全面地了解胃癌发生、发展的原因。

2011年，CHUNG 等[13]研究发现，PRNCR1 基因在前列腺癌细胞中表达上调，沉默前列腺癌细胞中PRNCR1的表达，可降低雄激素受体（androgen receptor，AR）的转录活性，表明PRNCR1在前列腺癌中通过调控AR的转录活性促进前列腺癌的发生。有研究显示，PRNCR1的基因多态性与结肠癌及胃癌的易感性相关[14]。此外，PRNCR1表达上调可以促进结肠癌细胞的增殖，沉默其表达可以抑制结肠癌细胞的细胞周期。而PRNCR1在胃癌细胞中的作用尚未有研究报道，其作用的分子机制更有待进一步研究。

本实验合成靶向人PRNCR1基因的双链siRNA序列，直接转染入胃癌细胞中，通过qRT-PCR检测转染后siRNA的沉默效果，通过MTT实验验证胃癌细胞增殖能力的变化，通过细胞侵袭转移实验验证胃癌细胞侵袭和迁移能力的变化，最终证实沉默PRNCR1在胃癌细胞中的表达可以抑制胃癌细胞的增殖、侵袭及转移能力，为以PRNCR1为靶点的胃癌基因治疗奠定理论基础。

[1]WANG S,ZHAO D,TIAN R,et al.FGF19 contributes to tumor progression in gastric cancer by promoting migration and invasion[J].Oncol Res,2016,23(4):197-203.

[2]PARALKAR V R,TABORDA C C,HUANG P,et al.Unlinking an lncRNA from its associated cis element[J].Mol Cell,2016,62(1):104-110.

[3]YANG L,QIU M,XU Y,et al.Upregulation of long non-coding RNA PRNCR1 in colorectal cancer promotes cell proliferation and cell cycle progression[J].Oncol Rep,2016,35(1):318-324.

[4]LI L J,JIA F,BAI P,et al.Association between polymorphisms in long non-coding RNA PRNCR1 in 8q24 and risk of gastric cancer[J].Tumour Biol,2016,37(1):299-303.

[5]FANG Y,FULLWOOD M J.Roles,functions,and mechanisms of long non-coding RNAs in cancer[J].Genomics Proteomics Bioinformatics,2016,14(1):42-54.

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[12]LI L,SUN R,LIANG Y,et al.Association between polymorphisms in long non-coding RNA PRNCR1 in 8q24 and risk of colorectal cancer[J].J Exp Clin Cancer Res.2013,32(1):104.

[13]CHUNG S,NAKAGAWA H,UEMURA M,et al.Association of a novel long non-coding RNA in 8q24 with prostate cancer susceptibility[J].Cancer Sci,2011,102(1):245-252.

（童颖丹 编辑）

Long non-coding RNA PRNCR1 promotes proliferation,invasion and migration of gastric cancer cells

Yi Cai
(Department of Emergency,the First Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

ObjectiveTo observe the expressions of long non-coding RNA PRNCR1 in gastric cancer MGC-803 cells and normal gastric mucosa epithelial GES-1 cells,and to study the effect of PRNCR1 on the proliferation,migration and invasion of gastric cancer cells by silencing the expression of PRNCR1.MethodssiRNA fragments (PRNCR1-siRNA)and control fragments (PRNCR1-NC)were designed,synthesized and transfected to gastric cancer cells.The expression of PRNCR1 was detected by qRT-PCR.Cell proliferation was detected by MTT.Migration and invasion of gastric cancer cells were detected by Transwell assay.ResultsThe expression of PRNCR1 in the MGC-803 cells was higher than that in the GES-1 cells.The expression of PRNCR1 was reduced by PRNCR1-siRNA in the MGC-803 cells.The proliferation,invasion and migration of the MGC-803 cells decreased after transfection of PRNCR1-siRNA.ConclusionsThe expression of PRNCR1 can be down-regulated by PRNCR1-siRNA,and PRNCR1-siRNA could inhibit the proliferation,invasion and migration of gastric cancer cells,which provides a theoretical foundation for gene therapy of gastric cancer targeting atPRNCR1gene.

long non-coding RNA;PRNCR1;proliferation;invasion;migration;gastric cancer

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.007

1005-8982（2017）12-0035-05

2016-04-15