凋亡抑制基因survivin与稽留流产发病机制的相关性研究

陈凤英　江欢　吴巧珠

【摘要】 目的 研究凋亡抑制基因survivin與稽留流产发病机制的相关性。方法 30例稽留流产排除胚胎染色体异常者为研究组， 正常早孕要求行人工流产患者30例为对照组。根据免疫组化结果分析survivin在稽留流产及正常早孕患者绒毛、蜕膜survivin表达情况以及两组患者细胞滋养层细胞、合体滋养层细胞中survivin阳性表达情况。结果 survivin主要在细胞滋养层细胞、部分容貌间质细胞、蜕膜细胞等位置， 呈核/浆表达， 在子宫内膜腺体中也较为常见， 呈胞浆阳性状态。研究组患者绒毛survivin表达为（160.28±21.34）， 蜕膜survivin表达为（167.52±16.78）， 均显著高于对照组患者， 差异具有统计学意义（P<0.05）。在细胞滋养层细胞、合体滋养层细胞中， 研究组患者survivin阳性表达分别为（6.42±3.16）%和（4.93±3.68）%， 均低于对照组患者， 差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 在稽留流产发病机制中， 凋亡抑制基因survivin具有较大的相关性。

【关键词】 凋亡抑制基因survivin；稽留流产；发病机制；相关性研究

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.18.035

稽留流产也叫做过期流产， 指的是胎儿或胚胎死亡后， 在宫内未及时排出。近年来， 稽留流产的发病几率整逐渐上升， 对孕产妇的身心健康、家庭稳定等， 都造成了不良的影响。目前， 对于稽留流产的具体发病机制尚未完全清除， 相关研究认为， 稽留流产的发病， 可能与凋亡抑制基因survivin存在一定的关系。基于此， 本文选择稽留流产排除胚胎染色体异常者30例及正常早孕要求行人工流产患者30例作为研究对象， 研究了凋亡抑制基因survivin与稽留流产发病机制的相关性问题。现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2015年1月～2016年12月稽留流产排除胚胎染色体异常者30例作为研究组， 停经时间6～10周， 平均时间（8.6±2.2）周， 年龄20～35岁， 平均年龄（27.9±3.3）岁，

尿人绒毛膜促性腺激素（HCG）呈阳性， B超检查无胎心搏动， 根据妇产科学标准进行检查， 诊断患者均为稽留流产患者。选择同期正常早孕要求行人工流产患者30例作为对照组， 停经时间6～10周， 平均时间（8.3±1.9）周， 年龄21～37岁， 平均年龄（28.1±2.7）岁， 尿HCG呈阳性， B超显示有胎心搏动。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 方法 稽留流产患者排胎后及正常早孕者行人工流产后， 分别选取绒毛组织各分成3小份， 注意避开出血、坏死及钙化部位。1份置于4%多聚甲醛中保存固定， 待制备石蜡切片行免疫组化检查， 其余2份用以后续实验的mRNA及western blot检测。采用免疫组化法观察survivin在两组患者绒毛滋养细胞上的表达， 首先进行石蜡包埋， 常规HE染色， 石蜡切片依次二甲苯、梯度酒精脱蜡至水， 置于柠檬酸盐缓冲液中放于微波炉， 中火煮沸15 min， 待其自然冷却后， 将切片取出， 以0.1 M的磷酸盐缓冲液（PBS）洗2 min×3次[1]。加3%过氧化氢， 封闭内源性过氧化物酶， 室温10 min， 0.1 M的PBS洗

2 min×3次。滴加一抗小鼠抗人单克隆抗体（1：200）4℃， 过夜。室温复温40 min， 0.1 M的PBS洗2 min×3次。滴加聚合物辅助剂， 室温20 min， 0.1 M的PBS洗2 min×3次。滴加辣根酶标记羊抗兔/小鼠免疫球蛋白（Ig）G多聚体， 室温30 min，

0.1 M的PBS洗2 min×3次。DAB显色， 镜下控制显色时间， 自来水洗涤中止显色。苏木素复染， 以盐酸酒精分化。梯度酒精脱水、二甲苯透明， 封片[2]。采用实时荧光定量PCR检测两组患者绒毛组织内survivin mRNA的表达水平， 总RNA提取， 去基因组， RNA纯度及完整性检测， 逆转录， 30℃保温10 min， 42℃保温60 min， 72℃保温10 min。定量PCR， 应用相对定量比较CT值法（2-ΔΔCt法）分析PCR结果[3]。采用Western blot检测两组患者绒毛组织内survivin蛋白的表达水平， 绒毛组织内细胞总蛋白提取及定量， SDS-PAGE胶制作， 加样电泳并转膜封闭， 然后进行孵育一抗及孵育二抗， 采用化学发光法（ECL）显影， 应用Bio-Rad Quantity One软件对蛋白条带进行定量分析[4]。

1. 3 观察指标 观察survivin分布情况；根据免疫组化结果分析survivin在稽留流产及正常早孕患者绒毛、蜕膜survivin表达情况以及两组患者细胞滋养层细胞、合体滋养层细胞中survivin阳性表达情况。

1. 4 统计学方法 采用SPSS16.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

survivin主要在细胞滋养层细胞、部分容貌间质细胞、蜕膜细胞等位置， 呈核/浆表达， 在子宫内膜腺体中也较为常见， 呈胞浆阳性状态。研究组患者绒毛survivin表达为（160.28±21.34）， 蜕膜survivin表达为（167.52±16.78）， 均显著高于对照组患者， 差异具有统计学意义（P<0.05）。在细胞滋养层细胞、合体滋养层细胞中， 研究组患者survivin阳性表达分别为（6.42±3.16）%和（4.93±3.68）%， 均低于对照组患者， 差异具有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

稽留流产是一种较为常见的疾病， 在单胎妊娠10～14周时， 发病几率约在2%左右。相关研究表明[5]， 稽留流产的发病可能与胚胎染色体异常、母体免疫反应及内分泌疾病、感染、环境、母体精神压力及不良生活习惯等因素相关。另外， 有研究认为凋亡抑制基因survivin与稽留流产的发病机制相关[6]。survivin是一种凋亡抑制蛋白， 作为抗凋亡基因具有广泛的分布， 能够对多种刺激诱发的细胞凋亡进行抑制， 在细胞正常生理活动中， 发挥着重要的作用。survivin具有较高的表达特異性， 通常只在胚胎组织、肿瘤组织中表达[7-10]。通常认为， 在过期妊娠、子痫前期、绒癌、葡萄胎等妇科疾病当中， survivin表达异常都具有一定的影响。稽留流产是一种早孕期病理妊娠， 其发病机制和母胎界面微环境稳态破坏相关。而在母胎界面滋养细胞中， survivin则具有广泛的表达。

survivin作为一种结构特殊的凋亡抑制蛋白， 能够发挥出调节细胞有丝分裂、抑制细胞凋亡等作用。survivin可在细胞浆中通过多种方式与Caspase-3、Caspase-7等进行结合， 对凋亡过程进行阻断。survivin可在细胞核中与CDK4进行结合， 从CDK4复合体中将癌基因蛋白质P21释放出来， P21可与线粒体Caspase-3相结合， 对其活性进行抑制， 并对细胞凋亡进行组织。经本文研究结果正是， 适量的survivin能够有效抑制凋亡， 确保滋养层细胞稳定分化， 对于滋养层细胞胎盘血管重铸有着较大帮助。

综上所述， 在稽留流产发病机制中， 凋亡抑制基因survivin具有较大的相关性， 同时对疾病具有一定的潜在的调控机制。

参考文献

[1] 耿尧， 牛成玲， 王凤羽. 荧光定量PCR检测稽留流产患者沙眼衣原体和解脲支原体结果分析. 中国优生与遗传杂志， 2011， 1（10）：19-20.

[2] 张娟， 王蓁. 稽留流产病人survivin、bax及caspase-3的表达. 齐鲁医学杂志， 2011， 2（10）：165-166， 168.

[3] 张心红， 丁子奇， 张艳婷. 药物流产配合清宫术治疗稽留流产358例临床观察. 临床医学， 2012， 9（20）：24-25.

[4] 谢杏美， 王玉霞. 米非司酮配伍米索前列醇治疗稽留流产和终止10～16周妊娠的效果比较. 实用妇产科杂志， 2012， 8（19）：693-695.

[5] 陈帆. CRT、IAP及TSP-1在人稽留流产蜕膜组织中的表达及意义. 郑州大学， 2013.

[6] 张娟. Survivin、bax及caspase-3在稽留流产中的表达. 青岛大学， 2011.

[7] 黄乐为. 凋亡相关基因Survivin、Caspase-3和Caspase-7在非小细胞肺癌组织中的表达及意义. 中国医科大学， 2007.

[8] 毕铁. 凋亡抑制蛋白Survivin在卵巢透明细胞癌中的表达. 大连医科大学， 2013.

[9] 杨斌. mTOR信号通路和survivin在人脑神经胶质瘤中的表达及临床意义. 郑州大学， 2013.

[10] 陈发弟. 米非司酮配伍米索前列醇治疗稽留流产的疗效观察. 中国计划生育学杂志， 2013， 11（23）：751-753.

[收稿日期：2017-03-16]