朱砂根皂苷高产愈伤组织的诱导与筛选

黄素华+陈清坤+林小婷+洪燕萍

摘要：采用比色法测定了以朱砂根（Ardisia crenata）胚、根、茎及叶等4种外植体诱导的愈伤组织中皂苷含量，筛选高皂苷含量的愈伤组织。结果表明，朱砂根的胚和根诱导出来的愈伤组织皂苷含量最高，达到24.07 mg/g和21.25 mg/g，茎和叶诱导的愈伤组织皂苷含量较低，根和茎诱导的愈伤组织生长较好。

关键词：朱砂根（Ardisia crenata）；愈伤组织；外植体；皂苷

中图分类号：Q944.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）12-2359-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.12.040

Induced and Selected of High Saponin Content Calluses of Ardisia crenata

HUANG Su-hua，CHEN Qing-kun，LIN Xiao-ting，HONG Yan-ping

（College of Life Science ，Longyan University，Longyan 364000， Fujian， China）

Abstract： Using colorimetric method to determine the content of saponin of calluses induced from embryos， roots， stems and leaves， the high saponin calluses of Ardisia crenata was screened. Results showed that the calluses which were induced from the embryos and roots contained the higher content of saponin， the amount of them was 24.07 mg/g and 21.25 mg/g respectively； while the calluses those were induced from stems and leaves contained significant lower content of saponin. And the growth of calluses from root and stem were higher than others.

Key words： Ardisia crenata； callus； explant； saponin

朱砂根（Ardisia crenata）為紫金牛科紫金牛属植物，又名大罗伞、平地木、红铜盘、硃砂根、八角金龙、金玉满堂、黄金万两，主要分布于中国长江流域[1]。朱砂根为1977年版中国药典收载的紫金牛属2种药用植物之一，其根具有较高的药用价值，可治疗急性咽峡炎、咽喉肿痛、上呼吸道感染、扁桃体炎、白喉、丹毒、淋巴结炎，能抗菌消炎退热、治肺病、劳伤吐血、跌打损伤、活血化瘀、关节风痛以及抗肿瘤等[2]。

陈尚钘等[1]研究发现朱砂根中含有醌类、有机酸、黄酮类、三萜皂苷、糖类等多种物质，其中三萜皂苷具有显著抗肿瘤、抗HIV等活性[3]，是朱砂根中重要的有效成分。朱砂根总皂苷抗肿瘤新药现已进入临床研究阶段，成为中国具有独立知识产权的中药二类口服抗癌新药物[4]。高效液相色谱法测定朱砂根皂苷含量，结果表明，在天然野生朱砂根的根中含量远高于茎、枝和叶，可达5.6%；在组培苗植株中同样是根的含量远高于茎和叶，为3.06%；在疏松愈伤组织和致密愈伤组织中分别为0.22%和0.058%[2]。

本试验采用朱砂根无菌实生苗的根、茎、叶、胚等不同器官为外植体进行愈伤组织的诱导，采用香草醛-高氯酸比色法测定总皂苷含量，系统地比较了不同外植体诱导的愈伤组织皂苷成分的含量，筛选皂苷含量高的愈伤组织，为进一步利用细胞培养技术进行朱砂根有效成分的生产打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

市售朱砂根盆栽苗木（带果实），室内培养数周。

齐墩果酸标样购买于Sigma公司，其他试剂均为分析纯。

1.2 朱砂根愈伤组织诱导

1.2.1 朱砂根无菌实生苗的准备 采取当年生长健壮、无病虫害、成熟的朱砂根果实，先用自来水冲洗干净，在无菌操作台中用体积分数75%乙醇浸泡 30 s，无菌水冲洗2次，每次3 min，再用体积分数0.1% HgCl2溶液浸泡 8 min，最后用无菌水冲洗3次，每次3 min，将种子接种于1/2MS培养基中，光照度1 500 lx，温度25 ℃下经30 d无菌萌发，获得无菌实生苗。

1.2.2 不同外植体愈伤组织的培养

1）胚诱导愈伤组织：采取当年生长健壮、无病虫害、成熟的朱砂根果实，先用自来水冲洗干净，在无菌操作台中用体积分数75%乙醇浸泡30 s后无菌水冲洗2次，每次3 min，再用体积分数0.1% HgCl2溶液浸泡8 min 最后用无菌水冲洗3次，每次3 min，取胚接种于MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L培养基中，每瓶接种3个胚，在光照度1 500 lx，光照时间12 h/d，温度25 ℃下经60 d诱导成愈伤组织。

2）根、茎、叶诱导愈伤组织：将无菌实生苗，分别取根（尽量为根尖）长度为0.5～0.8 cm，每瓶接3块；茎长度为0.5～0.8 cm，每瓶接3块；叶大小为0.5 cm×0.3 cm左右，每瓶接3片。在MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L培养基中在光照度1 500 lx，光照时间12 h/d，温度25 ℃下经60 d诱导成愈伤组织备用。

1.3 齐墩果酸标准曲线的制作

甲醇配制齐墩果酸母液1 mg/mL。分别取0.01～0.45 mL母液，50 ℃水浴蒸干，即取10～450 μg齐墩果酸，加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸，0.8 mL高氯酸，摇匀，70 ℃水浴反应15 min，立即冰浴降温终止反应。然后加入5 mL乙酸乙酯摇匀，560 nm下测定吸光度，以齐墩果酸量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，线性回归得齐墩果酸含量的标准曲线。

1.4 朱砂根愈伤组织皂苷含量的测定

1.4.1 愈伤组织干粉的准备 选择生长旺盛且没有出现褐化的材料，置真空干燥箱中50 ℃烘干，时间约为7 h。将干燥后的愈伤组织研磨至粉末状后，将4种愈伤组织粉末分别用封口袋密封保存，置于冰箱储藏待用。

1.4.2 愈伤组织中皂苷的提取 分别取0.5 g 4种外植体诱导愈伤组织粉末，加入10 mL体积分数 80%甲醇溶液，然后超声辅助提取20 min，中间间隔10 min，再超声提取20 min，取上清液。每种材料3个重复。

1.4.3 比色法测定朱砂根愈伤组织中皂苷的含量 分别取提取液溶液200 μL，50 ℃水浴蒸干。加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸，0.8 mL高氯酸，摇匀后，70 ℃水浴反应15 min，立即冰浴降温终止反应。然后加入10 mL乙酸乙酯摇匀稀释，静置20 min，在波长为560 nm下测定吸光度。

根据标准曲线计算朱砂根不同器官诱导的愈伤组织中皂苷含量，通过提取率计算胚、根、茎、叶中的总皂苷含量

1.5 数据处理

采用SPSS软件对试验数据分析。

2 结果与分析

2.1 朱砂根愈伤组织的诱导率

朱砂根的胚、根、茎、叶分别接种于培养基，20 d左右愈伤组织出现，并不断长大，持续观察至60 d，记录20、40、60 d时的愈伤组织数量及诱导率，结果见表1。

从表1可以看出，试验所用培养基对于朱砂根茎和根诱导愈伤组织是较为适宜的，诱导率分别达到了91.7%和88.3%，对于胚和叶相对较低，诱导率分别为80.0%和76.7%。从不同培养时间诱导率来看，根前期诱导率较低，40 d时诱导率为4种外植体中最低的，但到60 d后诱导率可以达到88.3%，说明其愈伤组织的诱导需要较长时间。

2.2 不同外植体诱导愈伤组织的长势

分别记录下各种愈伤组织在20、40、60 d时各个愈伤组织的长、宽、高。由于每种愈伤组织接种的瓶数较多，测量时随机抽取5瓶，分别记录下20、40、60 d的体积，采用SPSS分析胚、根、茎和叶之间的愈伤组织长势差异，结果见表2。经SPSS单因素方差分析及Duncan多重比較表明，20 d时生长量有显著差异，其中根和茎诱导的愈伤组织显著高于胚和叶；40 d时生长量有显著差异，其中根显著高于胚和叶，根与茎差异不显著，茎与胚、叶差异不显著；60 d时生长量无显著差异。从统计结果可以看出，根与茎在培养前期生长较快，生长量显著高于胚和叶，随培养时间增加，到60 d后，生长量的差异减弱。

2.3 朱砂根愈伤皂苷含量的测定

2.3.1 齐墩果酸标准曲线的制作 以齐墩果酸（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，线性回归得齐墩果酸含量的标准曲线。标准曲线方程为y=3.190 1x+0.012 2，R2=0.999 5。

2.3.2 朱砂根不同外植体诱导愈伤组织中皂苷含量 不同外植体诱导的愈伤组织中皂苷含量测定经SPSS方差分析和多重比较，结果见表2。结果表明，4种外植体诱导的愈伤组织中皂苷含量存在显著差异，胚和根愈伤组织样品粉末中的皂苷含量达到了24.07 mg/g和21.25 mg/g，显著高于茎和叶愈伤组织样品粉末中的皂苷含量，胚和根之间无显著差异，而茎又显著高于叶。朱砂根的胚和根诱导出来的愈伤组织皂苷含量较高，可以作为高皂苷含量愈伤组织诱导的外植体来源。

3 小结与讨论

皂苷含量的测定方法包括生物学测定法和化学测定方法等。比色法的显色反应灵敏、操作简单、成本低，同时也适合总皂苷的测定。本试验参考其他植物总皂苷含量的测定方法[5-11]，以齐墩果酸作为对照品，采用香草醛-冰乙酸-高氯酸比色法在560 nm测定朱砂根愈伤组织的皂苷含量。皂苷多易溶于热水、热乙醇、含水乙醇、热甲醇等，但难溶于或不溶于乙醚、石油醚等极性较小的有机溶液。因而，提取溶剂局限于热水、热甲醇以及热乙醇等，由于无水乙醇不能充分提取等原因，甄铧等[2]分别用水、甲醇、乙醇为溶剂提取朱砂根皂苷。结果表明，甲醇和95%乙醇效果与水比较有明显差异。综合考虑本试验选择了甲醇作为提取皂苷的溶剂。

本试验中采用的愈伤组织诱导培养基MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L，是在参考了相关文献[12-15]的基础上选定的，取其中各种外植体诱导率都较高的2，4-D 2.0 mg/L，同时考虑到NAA和6-BA对愈伤组织诱导也有一定的作用，综合考量选取了培养基配方。所采用的培养基对于朱砂根茎和根诱导愈伤组织是较为适宜的，诱导率分别达到了96.7%和88.3%，胚和叶的诱导率也能达到80.0%和76.7%。从不同时间诱导率变化来看，40 d时仅茎的诱导率相对较高，但到60 d时4种外植体的诱导率均较高，特别是根从40 d时的38.3%提高到88.3%，说明其愈伤组织的诱导可能需要较长时间。

从愈伤组织的生长量来看，20 d和40 d结果可以看到，根和茎诱导的愈伤组织生长量较大，但到了60 d时4种外植体诱导的愈伤组织生长量无显著差异。综合诱导率和生长速度来看，茎和根是愈伤组织来源的一个较好选择。

从皂苷含量比较而言，朱砂根的胚和根诱导出来的愈伤组织皂苷含量较高，可以作为高皂苷含量愈伤组织诱导的外植体来源。综合考量愈伤组织诱导率、生长量及皂苷含量，以根作为外植体诱导是获得高皂苷含量细胞株一个较好的选择。

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