降解石榴皮单宁菌株的筛选及鉴定

2017-07-15杨露张晓丽高迪李欣宇张立华

湖北农业科学 2017年12期

杨露+张晓丽+高迪+李欣宇+张立华

摘要：旨在分离、筛选出可降解石榴（Punica granatum L.）皮单宁的微生物，从自然条件下霉变的石榴皮上挑取野生菌株划线分离，获得纯种菌株，使用含单宁酸的溴酚蓝培养基初筛，再经含石榴单宁的液体培养基复筛。结果筛选出5株野生菌株，依次编号为1#～5#，其中3#和5#菌株的生物耗氧量（COD）去除率分别为60.7%和54.8%，经形态学观察初步鉴定这2株菌株同属于黑曲霉（Aspergillus niger）。

关键词：石榴（Punica granatum L.）皮单宁；黑曲霉（Aspergillus niger）；筛选；鉴定

中图分类号：S665.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）12-2266-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.12.016

Screening and Identification of the Pomegranate Husk Tannin-degrading Strains

YANG Lu， ZHANG Xiao-li， GAO Di， LI Xin-yu， ZHANG Li-hua

（College of Life Science， Zaozhuang University， Zaozhuang 277160，Shandong，China）

Abstract： In order to isolate the microorganisms which could degrade the tannin from pomegranate（Punica granatum L.） husk，the pure strains were obtained by using pomegranate husk as the culture medium after separating and puring. Then the strains were cultured on the plate that bromophenol blue and tannin acid were added to，and continually cultured in the liquid culture medium containing pomegranate tannin. The results showed that 5 strains numbered 1#～5# were screened，and the COD removal rate of 3# and 5# strain was 60.7% and 54.8%，respectively. The 2 strains were identified by morphological method，which belonged to Aspergillus niger.

Key words： tannin of pomegranate（Punica granatum L.） husk； Aspergillus niger； screening； identification

石榴（Punica granatum L.）为石榴科石榴屬落叶灌木或小乔木，又名安石榴。原产于伊朗、阿富汗等中亚一带，自西汉张骞出使西域引入中国。石榴适宜栽植范围较广，在中国除极寒地区外有20多个省市自治区均有栽培，已形成了云南蒙自、四川会理、山东枣庄、陕西临潼、新疆叶城、河南荥阳、安徽怀远等石榴主产区[1]。

石榴是一种药食两用植物，其根、叶、花、果实、果皮、种子均可入药，全身是宝[2，3]，其中，石榴皮有多种药用价值，其提取物对蟾蜍在体心率和心肌收缩力方面均有抑制作用[4]，对大鼠实验性胃溃疡有保护作用[5]；石榴皮具有一定的抗菌作用[6]、抗病毒作用[7]；药理试验结果表明石榴皮提取物具有一定的抗前列腺癌、皮肤癌、结肠癌和乳腺癌的作用[8，9]。石榴皮中的多酚类化合物是其主要的功效成分[10，11]。多酚类物质在石榴皮中含量丰富[12]，石榴多酚主要包括简单的酚酸和聚合态的单宁[13]，简单酚酸如没食子酸、鞣花酸、儿茶酚等，石榴皮中游离态的酚酸含量较少，多以单宁形式存在，单宁亦称鞣质，又以鞣花单宁为主，鞣花单宁在一定条件下可以水解为鞣花酸，研究表明鞣花酸具有显著的药理活性，被广泛用于医药、化妆品及食品领域[14，15]。目前从石榴皮中制取鞣花酸多采用加热酸解的方式[16]，该方式能耗高、污染重。据报道有些微生物能降解植物单宁产生鞣花酸，有人采用多菌种共培养降解橡椀单宁制备鞣花酸[17]，但鲜见生物降解石榴皮单宁制取鞣花酸的报道。本研究旨在分离自然条件下发酵石榴皮的菌株，经过初筛、复筛筛选出可降解石榴皮单宁的菌株，并对其鉴定，为后期石榴皮单宁酶的研究以及石榴皮的微生物发酵制取鞣花酸奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

石榴皮，石榴品种为大青皮，产自山东枣庄。

1.2 培养基

PDA培养基：马铃薯汁1 000 mL、葡萄糖20 g、琼脂20 g，121 ℃灭菌30 min。马铃薯汁制备：马铃薯去皮、洗净、切片。称取200 g放入1 000 mL去离子水中煮沸30 min，双层纱布过滤，滤液加水补至 1 000 mL。

0.5%单宁酸筛选培养基[14]：KH2PO4 4.38 g/L、（NH4）2SO4 8.76 g/L、CaCl2 88.00 mg/L、MgSO4·7H2O 880.00 mg/L、MnCl2·6H2O 18.00 mg/L、NaMoO4·2H2O 8.80 mg/L、FeSO4·7H2O 120.00 mg/L、溴酚兰40.00 mg/L、琼脂20.00 g/L、单宁酸5.00 g/L，过滤除菌（滤膜直径25 mm孔径0.45 μm），pH 5.5，121 ℃灭菌15 min。

0.5%石榴皮单宁发酵培养基[18]：葡萄糖10.00 g/L、NaNO3 3.00 g/L、KCl 0.50 g/L、KH2PO4 1.00 g/L、MgSO4·7H2O 0.50 g/L、FeSO4·7H2O 2.50 mg/L，121 ℃灭菌20 min。其中石榴皮单宁由石榴皮为原料提取制备。

1.3 野生菌株的获得与COD测定方法

新鲜石榴皮在30 ℃潮湿环境中自然霉变，4 d后划线分离。

1.3.1 分离与纯化挑取菌株，在PDA培养基上划线，30 ℃培养，3 d后重复以上操作，直至得到纯菌株。

1.3.2 初筛将纯化的菌种接种到溴酚蓝单宁酸筛选培养基上，30 ℃恒温培养3 d，观察菌落生长状况及菌落边缘颜色变化。

1.3.3 复筛将初筛得到的菌株分别接种于含0.5%石榴单宁发酵培养基的三角瓶中，以未接菌种的培养基作为对照，与上述培养液在相同条件下160 r/min、30 ℃摇床中培养4 d。对培养液的生物耗氧量（COD）进行测定，采用重铬酸钾法测定COD[19]。按式（1）計算COD去除率，以此作为菌株降解单宁能力的指标，筛选出较高COD去除率的菌株。

COD去除率=

■×100%（1）

1.4 菌株的鉴定

1.4.1 菌落特征的观察挑取菌丝点接种于PDA平板培养基上，在培养箱中30 ℃倒置培养，分别观察培养48、72、96 h菌落的形态，并拍照记录。

1.4.2 细胞形态的观察采用温室培养法临时装片，在显微镜下观察菌株菌丝和孢子的特征，并拍照记录。

2 结果与分析

2.1 野生菌株的获得

2.1.1 分离与纯化在0.5%单宁酸筛选培养基上接种分离，得到9株纯化菌株。

2.1.2 初筛结果没食子酸为单宁酸分解后的产物之一，可以使溴酚蓝由蓝紫色变为黄色。能产生单宁酶的菌株在加入溴酚蓝培养基中生长，降解产物没食子酸可以使培养基颜色由蓝紫色变为黄色（图1），以此来初步判断菌株降解单宁的能力。

将9株纯化菌株于30 ℃培养4 d，观察菌落周围的变色情况，据此判断各菌株分解单宁的能力。其中，5株菌株分解单宁能力较强，依次编号为1#～5#，均采用斜面培养保存。

2.1.3 复筛结果将初筛得到的5株菌株分别接种于0.5%石榴皮单宁发酵培养基中，测定菌株的COD，并计算COD去除率。由图2可知，3#和5#菌株的COD去除率分别为60.7%和54.8%，明显高于其他菌株，作为优质目的菌株，命名为Pomegranate pericarp-3（PP-3）、Pomegranate pericarp-5（PP-5）。并对PP-3、PP-5进行形态学鉴定。

2.2 菌株的鉴定

将PP-3菌株接种于PDA平板培养基中培养96 h，分别选取培养48、72、96 h的菌落进行形态观察，其形态见图3。显微镜下观察3#菌株的菌丝和孢子，其形态见图4。3#菌株的菌落形状呈球形，初为白色，后变为黑色颗粒状，背面略带黄色，质地为厚绒状，表面平坦，具同心轮。显微镜下观察，菌丝多核，有横隔，有足细胞，分生孢子梗长，梗基无横隔，表面光滑，孢子头粗糙，呈放射状，顶囊球形，表面有2列小梗，分生孢子球形，串生。根据魏景超[20]的鉴定方法，初步鉴定该菌株属于半知菌类（不完全菌）（Fungi Im-perfecti）从梗孢科（Moniliaceae）黑曲霉（Aspergillus niger）。

将PP-5菌株接种于PDA平板培养基中培养96 h，选取培养48、72、96 h的菌落进行形态观察，其形态见图5。显微镜下观察5#菌株的菌丝和孢子，其形态见图6。5#菌株的菌落形状呈球形，初为白色，后变为黑色颗粒状，背面白色，质地为厚绒状，中心凸起，具同心轮。显微镜下观察，菌丝具横隔，具足细胞，分生孢子梗长，梗基无横隔，表面光滑，孢子头粗糙，呈放射状，顶囊球形，表面有2列小梗，分生孢子球形，串生。根据魏景超[20]的鉴定方法，初步鉴定该菌株属于半知菌类（不完全菌）从梗孢科黑曲霉。

3 小结与讨论

单宁是高等植物的次生代谢产物，是结构复杂的多酚类化合物，易与蛋白质包括酶蛋白结合形成难溶于水的复合物，从而抑制酶活性降低机体代谢，具有广泛的抑菌效果。因此，只有能够产单宁酶的微生物才能在富含单宁的培养基上生长。该试验以石榴单宁为营养物，获得对石榴单宁有抗性的菌株，并对其进行形态学鉴定。

单宁的某些降解产物能与溴酚蓝发生颜色反应，因此，可以通过观察培养基上菌落周围的颜色变化对具备单宁降解能力的微生物进行初筛[21]。对于好氧微生物发酵，底物的降解率、产物的生成量和COD去除率都可以作为反映微生物对底物降解能力的指标[22]。由于培养液为成分复杂的混合物，底物与产物的测定相对困难，COD的检测更为简便，且其去除率能够准确地反映微生物降解石榴单宁的能力，可以用COD去除率来代表微生物对单宁的降解率。乔家运等[23]从霉变的葡萄上分离出的单宁降解菌—黑曲霉SL-5COD去除率为49.4%，栾丽杰等[24]筛选出能分解涩柿单宁的黑曲霉COD去除率为43.2%，本研究经初筛和复筛，筛选出能够有效降解石榴单宁的2株菌株PP-3和PP-5，COD去除率分别为60.7%和54.8%，表明这2株黑曲霉对石榴单宁的降解能力较强，有望成为降解石榴皮渣的工程菌株。

传统的形态学鉴定具有较高的准确性和稳定性，且简便经济，是仍被广泛使用的菌类鉴定方法[25]。本研究所分离菌株的菌落、菌丝及孢子形态特征明显，因此也选用传统的形态学方法对菌株进行了鉴定，虽然PP-3和PP-5菌落、孢子囊形态有一定的差别，但都具备黑曲霉的共同特征，初步推断两菌株均为黑曲霉。

石榴果汁加工企业会产生大量石榴皮渣，多被废弃，造成资源浪费。化学降解石榴皮单宁制取鞣花酸因能耗高、污染重，其应用受到限制[26]。后续研究将通过基因工程技术改造菌种进一步提高降解单宁的能力，以及优化菌种的发酵条件，以期将目的菌株用于工业处理石榴皮渣生产相关酶类及鞣花酸等降解产物。

参考文献：

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