木棉褐斑病病原菌鉴定及生物学特性

秦人全++林江++王洪星++王红刚++徐罗娜++于旭东

摘要：针对在海南发生的一种木棉叶片褐斑病，为明确该病致病病原，采用形态学鉴定方法对其致病菌进行种类鉴定，并对该病原菌的生物学特性进行了初步研究。研究结果表明，引起木棉叶片褐斑病的致病菌为半知菌亚门多主棒孢霉菌（Corynespora cassiicola）；该病原菌菌丝在PDA培养基上生长最适温度为28 ℃、pH值为7～8，光照环境对菌丝生长无明显影响，以麦芽糖为碳源、硝酸钠为氮源比较适合该病原菌丝的生长。

关键词：木棉；褐斑病；病原鉴定；生物学特性

中图分类号： S436.8文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）09-0101-04

木棉Ceiba pentandra（Linn.）Gaertn.属木棉科高大落叶乔木，原产于热带美洲和东印度群岛。目前，广泛引种于东南亚及非洲热带地区[1]，我国主要分布于广西、云南、海南、广东、四川、贵州和福建等地。其树生长迅速，加之花、根、皮、木材和种子等经过不同工艺加工处理后均可利用，兼具经济、药用和观赏的价值[2-5]。目前，木棉在生产中不仅是优良的林用木材和绿化树种，而且其蒴果纤维更是优良的纺织材料，其纤维与其他天然材料相比，具有不易潮湿、抗压力强、保暖性好和不蛀不霉变等特性，是一种极具市场前景的新型生态纺织材料[6]。由于木棉兼具优良林用、绿化和纺织等多方面的经济价值，近年来，我国南方地区种植面积越来越大，尤其海南在绿化宝岛和打造木棉之乡等相关项目的支持下，目前，整体种植面积已达10 000 hm2[7]。关于木棉研究，主要集中于纤维开发利用和优良品种选育2个方面，然而随着木棉种植面积的逐渐增大，必将导致病虫害大面积发生，影响其产量和质量，而且国内外关于木棉种植中病虫害的研究报道甚少。2014年11月在海南省儋州市木棉育苗基地大面积发生木棉褐斑病，笔者对海南多地的木棉分布区域进行采样调查，发现该病害在海南已经大面积发生。为明确木棉褐斑病病原，本试验通过柯赫氏法则分离纯化病原菌后，采用形态学描述方法对该致病菌进行了鉴定，并对致病菌进行了生物学特性初步研究，以期为木棉褐斑病的发生及综合防治提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试病样

试验分离所用病样均采集于海南大学儋州校区农科教学实习基地中发病的木棉植株。

1.1.2供试药品

葡萄糖、谷氨酸、KH2PO4、NaOH、甘露醇、NH4NO3、KNO3、KCl、蔗糖、MgSO4、脲、Ca（NO3）2、NaNO3、盐酸、Fe2（SO4）3、可溶性淀粉均为分析纯，广州化学试剂厂生产；麦芽糖、琼脂粉、α-乳糖均为生化试剂，国药集团化学试剂有限公司生产。

1.2试验方法

1.2.1木棉褐斑病症状描述

通过基地观察木棉褐斑病的典型症状，记录其发病特点，并对典型症状进行拍照。

1.2.2木棉褐斑病病原分离及致病性测定

取基地发病木棉叶片带回實验室后，采用常规组织分离法进行分离[8]。分离时取病健交界处的叶片组织，接种到PDA培养基上，置于生化培养箱中25 ℃培养5 d，期间取样进行镜检。然后挑取较纯菌落，进行纯化处理，并对纯化后的菌落、菌丝体、病原孢子等进行形态描述和显微拍照。根据柯赫氏法则操作步骤，采用针刺法接种菌饼的方式对温室盆栽苗进行致病性测定[9]，处理时以接种不带菌的培养基作为空白对照，观察记录，5 d后对接种发病叶片再次进行分离病原。

1.2.3木棉褐斑病病原鉴定

将纯化病原菌用PDA培养基于25 ℃下培养产孢后，制作临时玻片进行显微观察。根据菌落特征，菌丝形态，分生孢子大小、形态及颜色等相关特征。查阅相关文献进行比对后，确定病原菌的分类地位[10-15]。

1.2.4木棉褐斑病病原菌生物学特性研究

1.2.4.1不同温度对菌丝生长的影响在生长良好菌落边缘，用直径5 mm打孔器打取菌丝块，接种于PDA培养基上，置于5、10、15、20、25、28、30、32、35、40 ℃ 10个不同温度中进行培养，培养7 d后用十字交叉法测量个菌落直径，每个处理重复5次。

1.2.4.2不同pH值对菌丝生长的影响在无菌条件下，用灭菌的0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH溶液，将经过灭菌的培养基pH值分别调节至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0等8个梯度。经接种病原菌（直径5 mm）后，置于25 ℃中进行培养，7 d后用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复5次。

1.2.4.3不同碳源对菌丝生长的影响以Czapek培养基为基础培养基，用等量α-乳糖、麦芽糖、葡萄糖、D-甘露糖和可溶性淀粉分别替代Czapek培养基中蔗糖作为碳源，配制不同碳源的培养基。然后接种病原菌（直径5 mm）于不同碳源的培养基上，25 ℃培养7 d后用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复5次。

1.2.4.4不同氮源对菌丝生长的影响以Czapek培养基为基础培养基，用等量的NaNO3、Ca（NO3）2、谷氨酸、酵母膏、脲和NH4NO3分别替代Czapek培养基中KNO3作为氮源，配制不同氮源的培养基。然后接种病原菌（直径5 mm）于不同氮源的培养基上，25 ℃培养7 d后用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复5次。

1.2.4.5不同光照条件对菌丝生长的影响在PDA培养基上接种纯化病原菌（直径5 mm）后，分别置于全黑暗处理、全光照处理、光暗交替（光—暗周期12 h—12 h）3种光照环境中25 ℃培养7 d后用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复5次。

1.2.5数据统计分析

用Excel统计软件计算菌丝生长抑制率，采用SPSS 19.0软件进行分析各重复处理间的方差值和不同处理间的显著性检验。

2结果与分析

2.1木棉褐斑病危害症状

木棉褐斑病主要危害木棉叶片及茎秆，叶片发病初期，被侵染叶片首先表现为暗褐色小点（图1-A），后期病斑逐渐扩大为圆形、梨形甚至椭圆形的不规则病斑，病斑边缘褐色至暗褐色，中间褐色，病健交界处带有明显黄色晕圈（图1-B）；发病严重时，中央组织坏死变脆或穿孔，或多个病斑联合成块，中间灰褐色腐烂，湿度大时，叶片表面出现橘黄色水珠（图1-C）。茎秆初侵染表现为褐色小点，之后病斑逐渐扩大，成椭圆形分布在表面，呈褐色或黑色。发病严重时，中央组织变黑，周围病斑联合在一起。

2.2木棉褐斑病病原菌致病性测定

在木棉发病叶片上，初次分离共得到炭疽菌（Bacillus spp.）、链格孢菌（Alternaria spp.）、弯孢霉菌（Curvularia spp.）、镰刀菌（Fusarium spp.）、多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）和2种未知菌等7種病原菌。采用温室盆栽苗菌饼接种方法，对分离得到的病原菌进行致病性测定。结果表明，盆栽木棉叶片在接种3 d后，可看见接种部位出现褐色小病斑，并伴有扩散趋势（图2-A）。连续观察10 d后，接种叶片病斑扩大，病健交界处出现明显黄色晕圈，并伴有叶片掉落现象。而用不带菌的空白培养基接种后仅出现针刺的机械损伤，呈现黑色小点，连续观察10 d，接种部位无明显扩展（图2-B）。对显症部位再次进行取样分离，所得到的病原菌与接种病原一致。接种试验表明，分离的病原菌是木棉褐斑病的致病菌。

2.3木棉褐斑病病原菌形态学鉴定

通过对病原菌培养菌落形态、菌丝体特征、分生孢子梗和分生孢子形态进行显微观察，并查阅相关病原真菌形态描述和分类文献资料，初步确认，引起木棉褐斑病的致病菌为半知菌亚门（Deuteromycotina）、丝孢纲（Hyphomycetes）、丝孢目（Hyphomycetales）、暗色菌科（Dematiaceae）、棒孢属（Corynespora）的多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）。

该病原菌在PDA培养基上，菌落呈辐射状向四周平展生长，菌落舒展，边缘规则，绒毛细发状，菌落培养初期颜色较浅，呈灰白色，后期逐渐变为灰褐色；菌丝体半透明、具分枝情况，初期无色，后期淡褐色。PDA培养基上培养的分生孢子梗直、细、长、稍弯或屈膝状，垂直着生于菌丝顶端，单生或分枝。分生孢子梗产孢处膨大，浅褐色至褐色。分生孢子孔出、单生或顶生，经分离培养后变长。传代培养2～3次后形态稳定，基部膨大，顶端钝圆，中后部分细长直或稍弯，多数呈棍棒状，平均大小38.92 μm×8.35 μm，光滑成熟分生孢子3～5个隔膜。

2.4木棉褐斑病病原菌生物学特性

2.4.1温度环境对病原菌菌丝生长的影响

温度对病原菌菌丝生长的影响见表1，病原菌菌丝在5～40 ℃不同温度条件下均可生长，但低温和高温生长较为缓慢，而最适生长温度为28 ℃，连续培养7 d后，菌落直径平均值为68.8 mm，菌丝生长速率为9.8 mm/d。

2.4.2不同pH值对病原菌菌丝生长影响

从表2可以看出，病原菌菌丝在pH值为4.0～11.0范围内的不同酸碱环境条件下均可生长，但pH值在5.0～9.0之间生长比较良好，其中pH值为6时，菌落平均直径达62.80 mm。总体来说，在偏碱性条件下生长比较缓慢，微酸性条件下有利于菌丝生长。

2.4.3不同碳源、氮源对病原菌菌丝生长的影响

测定结果表明，多主棒孢霉病原菌在所选择的5种碳源和氮源配制的培养基中均能正常生长，但不同碳源、氮源对病原菌菌丝生长的差异较为明显。从表3可以看出，所选择的5种碳源以麦芽糖比较适合菌丝的生长，培养5 d菌落直径达86.60 mm，其生长速率为12.37 mm/d，其次是D-甘露糖，可溶性淀粉作为碳源的生长最慢，生长速率仅为7.68 mm/d。氮源病原菌最适生长氮源为硝酸钠，其生长速率为8.71 mm/d，其次是硝酸钙，以硝酸铵生长最慢。

2.4.4光照对病原菌生长的影响

通过连续培养7 d后，发现不同光照下病原菌菌丝的生长无明显差异，无论是在连续黑暗还是在连续光照等条件下，其菌丝菌落直径和菌落生长速率基本一致。平均生长速率值分别为13.0 mm/d和 12.8 mm/d，不同处理间差异不显著。

3结论与讨论

本试验通过对木棉叶片上的发病部位经病原菌分离纯化、致病性测定和形态特征观察，确定引起木棉褐斑病的病原菌是多主棒孢霉菌Corynespora cassiicola。该菌在自然条件下可寄生于多种植物的种子、枯死部位或土壤中，其寄主范围广泛，可以侵染烟草、黄瓜、番茄、木瓜、香蕉、广藿香和一串红等多种植物，引起植株叶片褪绿、坏死等症状[16-21]。多主棒孢霉菌过去作为一种次要病害未引起相应关注，自北美热带地区暴发番茄棒孢霉叶斑病和橡胶棒孢霉叶斑病以来，近年来在我国已由次要病害上升为主要病害，而且危害程度日益严重[22]。木棉叶斑类的病害较多，危害较为严重的有炭疽病、拟盘多毛孢叶斑病、黑痣病和叶点霉圆斑病等，高拓等在云南红河所分离的致病菌为尾孢属真菌，其病原主要危害叶片，并未发现有危害树干的情况[23]，而本试验中所分离的多主棒孢霉病原菌，在后期进行危害调查时发现，该病原菌除危害木棉叶片外，还可危害木棉树干，造成树干发病部位坏死。

目前，国内学者对不同作物上的多主棒孢菌株进行了基础生物学特性研究。不同作物上多主棒孢菌株的生物学特性有所不同。对该菌的相关生物学特性研究表明，多主棒孢的分生孢子可借风、雨或农事操作在田间传播，远距离的传播以种子传播为主，而且休眠菌丝可以在种子表皮或种皮内潜伏，成为后期危害的初侵染源。在菌落生长研究中，众多研究表明，该菌菌丝生长最适温度为28 ℃，产孢最适温度为30 ℃，而萌发温度为15～35 ℃，萌发对湿度要求较高，相对湿度达90%以上才能萌发，水滴中萌发率最高[24-26]，因此，高温、高湿条件有利于棒孢叶斑病的流行和蔓延。通过平行比较发现，张贺对巴西橡胶树棒孢落叶病的研究结果[24]与本结果基本一致，在微酸至中性环境中生长较好，但与罗霓等从番木瓜和木薯上所分离的多主棒孢霉测定结果[27-28]差异较大，原因可能是不同寄主植物上的生理小种之间的差异。由于供试碳、氮源与培养条件的不同，导致对碳源和氮源的利用之间也会有所差异。