杆状病毒ctl基因的进化分析

朱姗颖++康启鑫++武亚楠++陈奕蓄++王文兵++何华纲

摘要：苜蓿尺蠖核型多角体病毒（AcMNPV）芋螺毒素类似多肽（CTL）具有酚氧化酶抑制剂活性，在农业害虫的生物防治领域具有潜在的应用价值。为了揭示杆状病毒ctl基因的进化特点，对杆状病毒CTLs进行多序列比对分析和分类研究。结果表明，杆状病毒CTLs可分为Ⅰ型、Ⅱ型，2种类型的CTLs都具有相同的二硫鍵骨架，但涉及昆虫酚氧化酶抑制剂活性的酪氨酸残基在2种类型CTLs中的数目、位置明显不同；另外，Ⅰ型CTLs、Ⅱ型CTLs的理化性质也存在明显差异，疏水性氨基酸平均含量分别为29.7%、21.3%，净电荷平均值分别为-3.56、+0.507，等电点平均值分别为3.86、7.32。由此推测，Ⅰ型CTLs、Ⅱ型CTLs在功能上可能存在着重要分化。

关键词：杆状病毒；ctl基因；分类；进化

中图分类号：Q753 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）09-0022-05

芋螺毒素（conotoxin）是由海洋软体动物芋螺分泌的一类用于自卫和捕食的活性多肽，一般由10～30个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸（C）。芋螺毒素能特异性地作用于钾、钠、钙等离子通道、细胞膜上的各种神经递质、激素的受体，从而干扰细胞或神经中的信号传递，在治疗慢性疼痛、急性疼痛、神经保护等方面具有广泛的应用前景。根据保守的信号肽序列，芋螺毒素可分为A、M、O、I、P、S、T等超家族；进一步依据其半胱氨酸骨架及药理活性，又可分为α、μ、ω、δ、Ψ、σ、λ、κ、γ等家族[1]。

1992年，Eldridge等从苜蓿尺蠖核型多角体病毒（Autographa californica nucleopolyhedrovirus，简称AcMNPV）中鉴定了1个基因，该基因编码的蛋白质序列与ω-芋螺毒素具有一定的相似性且具有相同的二硫键骨架（C1—C2—C3C4—C5—C6），因此将其命名为类芋螺毒素基因（conotoxin-like，简称ctl）[2]。但Eldridge等通过体内、体外试验都未能证明杆状病毒ctl基因的任何功能[2-3]。曹青等发现，AcMNPV CTL不仅对金黄色葡萄球菌、微球菌等具有显著的抗菌活性，还可对酚氧化酶起到抑制作用，能阻止昆虫血液的黑化[4-5]。本研究从GenBank数据库中收集已知的杆状病毒ctl基因，对其编码的CTLs进行较全面系统的进化分析，在此基础上对杆状病毒ctl基因进行分类，以期为该基因的功能研究提供理论依据。

1材料与方法

1.1基因序列和蛋白质序列的获取

以AcMNPV ctl基因（GenBank登录号：L22858）作为种子序列，在GenBank数据库中进行BLAST，获取杆状病毒ctl基因序列，使用DNAStar软件进一步推导出对应的蛋白质序列。芋螺毒素ω-MⅦA、虎纹蜘蛛毒素HWTX-X、家蝇酚氧化酶抑制剂MdPOI等抑制剂半胱氨酸结（inhibitor cystine knot，简称ICK）家族（也称knottin家族）成员的氨基酸序列从KNOTTIN数据库（http：//knottin.cbs.cnrs.fr）中获得。

1.2多序列比对分析

使用SignalP 3.0软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0）预测杆状病毒CTL蛋白质的信号肽，进而根据信号肽的位置，推导CTL成熟肽。使用ClustalW软件（http：//www.genome.jp/tools/clustalw）对杆状病毒CTL成熟肽进行多序列比对分析，并采用同样的方法对ICK家族进行多序列比对分析。

1.3系统进化树的构建

应用MEGA 4.0软件通过邻接（N-J）法构建系统进化树。

1.4蛋白质理化性质分析

用DNAStar软件统计杆状病毒CTL成熟肽、ICK家族成员的疏水性氨基酸含量，并计算净电荷、等电点（pI）。

2结果与分析

2.1杆状病毒ctl基因的分布

以AcMNPV ctl基因为种子，在GenBank数据库中进行BLAST分析。结果显示，在全基因组已测序的50多个杆状病毒中，有22个杆状病毒含有ctl基因，约占40%。在这些杆状病毒中，ctl基因的数目一般为1～2个。例如，AcMNPV、豆天蛾核型多角体病毒（Clanis bilineata NPV，简称ClbiNPV）等16种NPVs和棉铃虫颗粒体病毒（Helicoverpa armigera granulosisvirus，简称HearGV）、八字地老虎颗粒体病毒（Xestia c-nigrum GV，简称XecnGV）等2种GVs都只有1个ctl基因（表1）；蓖麻蚕核型多角体病毒（Samia cynthia NPV，简称SacyNPV）、柞蚕核型多角体病毒（Antheraea pernyi NPV，简称AnpeNPV）等6种NPVs均有2个ctl基因（表2），而家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori NPV，简称BmNPV）等杆状病毒中则没有该基因。在杆状病毒中，ctl基因序列一致性在74%～100%之间，推导的蛋白质CTLs的氨基酸序列一致性为 40%～78%。对不同杆状病毒CTLs进行信号肽的预测分析，发现所有CTLs的N端都有1段信号肽序列，其氨基酸组成的保守性较低，而成熟肽的氨基酸序列保守性较高。

2.2杆状病毒CTLs的分类

对预测的杆状病毒CTLs成熟肽序列进行多序列比对分析，可将杆状病毒CTLs分为2种类型，分别命名为Ⅰ型CTLs、Ⅱ型CTLs（图1）。Ⅰ型CTLs的前体肽都含有53个氨基酸残基（aa），预测的成熟肽均为30个氨基酸，成熟肽的氨基酸组成相当保守，为ACA（/S）E（/D）TGAVCV（/I）HN（/S/D）DECCSGACSPV（/I）FNYCLPQ（/E/D），包括AcMNPV等4种NPVs编码的CTLs，及SacyNPV、AnpeNPV等含有2个ctl基因的NPVs所编码的CTL-1（表1、表2）。

Ⅱ型CTLs的前体肽含有48～68个氨基酸，长度变异主要位于信号肽部分，而成熟肽大部分为29个氨基酸，个别为35、32个氨基酸，成熟肽的氨基酸组成较为保守，为CTE（/D）T（/D）GR（/K）NCK（/Q）Y（/T）S（/N）Y（/A/D/N）ECCSG（/N）ACSAA（/V/L）FG（/K）F（/Y）CLH（/K/P）R，包括ClbiNPV等11种NPVs、HearGV等2种GVs编码的CTLs及含有2个ctl基因的NPVs所编码的CTL-2（表1、表2）。

采用CTLs成熟肽的氨基酸序列对杆状病毒进行系统发育分析，发现所有编码Ⅰ型CTLs的杆状病毒聚于1支，而所有编码Ⅱ型CTLs的杆状病毒聚于另1支（图2）。

2.3Ⅰ型、Ⅱ型CTLs成熟肽的保守位点

多序列比对分析表明，在Ⅰ型CTLs、Ⅱ型CTLs的成熟肽中均含有6个高度保守的半胱氨酸残基（C），二硫键骨架为C1—C2—C3C4—C5—C6。酪氨酸（Y）是涉及昆虫酚氧化酶抑制剂活性的关键位点，因此本研究对2类CTLs中的酪氨酸的分布进行统计分析。结果显示，Ⅰ型CTLs都有1个保守的酪氨酸残基，位于C5～C6之间；在Ⅱ型CTLs中，除了茶小卷叶蛾核型多角体病毒（Adoxophyes honmai NPV，简称 AdhoNPV）、棉褐带卷蛾核型多角体病毒（Adoxophyes orana NPV，简称AdorNPV）的CTL缺乏酪氨酸残基，ChchNPV CTL、OrleNPV CTL-2只有1个酪氨酸残基之外，其余CTLs在C2～C3之间都有2个保守的酪氨酸残基。除了这2个保守的酪氨酸残基，黎豆夜蛾核型多角体病毒（Anticarsia gemmatalis NPV，简称AgNPV）、HearGV、XecnGV的CTLs还有1个酪氨酸残基，其位置与Ⅰ型CTLs中的一致。此外，在HearGV CTL、黄杉毒蛾核型多角体病毒（Orgyia pseudotsugata MNPV，简称 OpMNPV）CTL-2的C1之前还有1个额外的酪氨酸残基（图1）。

2.4Ⅰ型、Ⅱ型CTLs成熟肽的理化性质

本研究对Ⅰ型、Ⅱ型CTLs的净电荷、等电点、疏水性氨基酸含量等理化性质进行了比较分析，表3结果显示，Ⅰ型CTL在pH值7.0时净电荷范围为-4.10～-3.10（平均值为-3.56），等电点（pI）范围为3.69～3.96（平均值为 3.86），疏水性氨基酸占26.7%～30.0%（平均值为 29.7%）；而Ⅱ型CTLs在pH值7.0时净电荷为-0.11～+1.89（平均值为+0.507），pI值为6.88～8.01（平均值为7.32），疏水性氨基酸占17.2%～28.6%（平均值为 21.3%）。本结果表明，杆状病毒Ⅰ型、Ⅱ型CTLs的理化性质存在明显差异，这暗示2类CTLs在功能上可能存在分化。

注：括号内数据为平均值。AcCTL为苜蓿尺蠖核型多角体病毒CTL；ClbiCTL为豆天蛾核型多角体病毒CTL；SacyCTL-1、SacyCTL-2为蓖麻蚕核型多角体病毒CTL-1、CTL-2；AhIAAI为千穗谷（Amaranthus hypochondriacus）α-淀粉酶抑制剂；GsGUR为匙羹藤（Gymnema sylvestre）甜味抑制蛋白gurmarin；MjTI1为紫茉莉（Mirabilis jalapa）胰蛋白酶抑制剂；AsAST-A为海洋生物Asteropus simplex抗菌肽；MVⅡA为芋螺毒素ω-MVⅡA；AlALO1为长臂天牛（Acrocinus longimanus）抗菌肽；MdPOI为家蝇（Musca domestica）酚氧化酶抑制剂；PaAMP1为美洲商陆（Phytolacca americana）抗菌肽；HWTX-X为虎纹蜘蛛（Ornithoctonus huwena）毒素Huwentoxin-X。

2.5杆状病毒CTLs与ICK家族的比较分析

杆状病毒CTLs属于抑制剂半胱氨酸结（inhibitor cystine knot，简称ICK）家族，多序列分析表明，杆状病毒CTLs与芋螺毒素ω-MⅦA、虎纹蜘蛛毒素HWTX-X、紫茉莉胰蛋白酶抑制剂MjTI1、匙羹藤甜味抑制蛋白GsGUR、美洲商陆抗菌肽PaAMP1、家蝇酚氧化酶抑制剂MdPOI等具有相同的二硫键骨架，但氨基酸序列一致性较低，仅为16.7%～33.3%（图3）。

在理化性质方面，AhIAAI、GsGUR、MjTI1、AsAST-A等都带负电荷，等电点分别为6.06、4.97、4.81、3.04， 疏水性氨

基酸含量分别为9.4%、25.7%、24.3%、44.4%；而ω-MⅦA、AlALO1、MdPOI、PaAMP1、HWTX-X等都帶正电荷，等电点为8.00～8.53，疏水性氨基酸含量分别为6.7%、11.8%、23.7%、21.1%、14.3%（表3）。由此可见，不同的ICK家族成员在理化性质上存在较大差异，不过杆状病毒Ⅰ型CTLs的净电荷（平均值为-3.56）、等电点（平均值为3.86）与 MjTI1、AsAST-A、GsGUR等比较接近。

3讨论与结论

抑制剂半胱氨酸结家族，又称knottin家族，该家族是由富含半胱氨酸残基的小分子蛋白质组成，广泛存在于各种动物、植物和微生物中[6]。研究发现，海洋生物芋螺中的芋螺毒素属于ICK家族。在ICK家族中，HWTX-X、Pa-AMP、MdPOI等大量成员都与芋螺毒素ω-MⅦA具有相同的二硫键骨架，即C1-C2-C3C4-C5-C6。这些类MⅦA（MⅦA-like）蛋白往往具有复杂的生物学功能，例如，HWTX-X是虎纹蜘蛛产生的一种神经毒素，在捕食过程中发挥作用[7]。PaAMP1是从美洲商陆种子中分离的抗菌肽，对多种真菌和革兰氏阳性菌具有明显的抑制活性[8]。MdPOI是从家蝇蛹中发现的酚氧化酶抑制剂（phenoloxidase inhibitor，简称POI），对家蝇幼虫的酚氧化酶具有显著的抑制作用[9-10]。从二硫键骨架看，杆状病毒CTLs也属于ICK家族中类MⅦA蛋白。杆状病毒CTLs很少带有正电荷，而带正电荷氨基酸对芋螺毒素的镇痛功能是必需的，因此，尽管最初杆状病毒CTLs因与芋螺毒素具一定的同源性而被命名，但是杆状病毒CTLs并不像芋螺毒素那样具有镇痛活性（笔者的相关研究数据未发表）。另外，曹青等已证实，AcMNPV CTL对金黄色葡萄球菌、微球菌、短小芽孢杆菌等多种临床致病菌的生长有显著抑制功能，目前尚不明确抑菌活性对于杆状病毒的生物学意义[4]。还有研究发现，AcMNPV CTL具有酚氧化酶抑制活性，能阻止昆虫血液的黑化[5]。

昆虫酚氧化酶不仅在昆虫发育过程中具有重要的生理功能，如参与表皮的鞣化、硬化、伤口愈合等，还在昆虫免疫防御反应中起着重要作用，它可使病原微生物表面产生黑色素沉淀，通过黑色素包囊反应来隔离和抵抗病原物，并在黑色素形成过程中产生醌及其衍生物，导致活性氧的积累，从而对病原物起到杀伤作用[11]。已有研究表明，昆虫酚氧化酶与黑化幼虫表现出的较强的杆状病毒抗性有关[12]。Trudeau等用 AcMNPV 感染美洲棉铃虫时发现，气管上皮细胞的感染位点上出现了酚氧化酶介导的黑化及包囊反应[13]。由此可见，昆虫酚氧化酶在宿主防御杆状病毒的过程中发挥着重要作用。昆虫体内存在内源性酚氧化酶抑制剂，能在纳摩尔（nmol）水平上高效地竞争性抑制酚氧化酶活性[9]。Cao等的研究表明，AcMNPV CTL是病毒来源的酚氧化酶抑制剂，它可能在一定程度上能抑制昆虫宿主对杆状病毒的防御反应[5]。

Daquinag等对家蝇MdPOI的氨基酸序列及蛋白质结构进行解析发现，MdPOI成熟肽由38个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸、赖氨酸，其中6个半胱氨酸形成3对二硫键（C1—C2—C3C4—C5—C6），且在C5～C6之间的酪氨酸残基（Y）经羟化修饰为多巴残基，该位点与酚氧化酶抑制剂的竞争性抑制活性有重要关系[10]。本研究将杆状病毒CTLs分为2类，即Ⅰ型CTLs、Ⅱ型CTLs，其中Ⅰ型CTLs在C5～C6之间也都有1个保守的酪氨酸残基，目前尚不清楚该位点是否存在羟化修饰，而大部分Ⅱ型CTLs在C2～C3之间有2个保守的酪氨酸残基。另外，与Ⅰ型CTLs类似，3个Ⅱ型CTLs（AgNPV CTL、HearGV CTL和XecnrGV CTL）在C5～C6之间还有1个酪氨酸残基。目前尚不清楚Ⅱ型CTLs是否也具有酚氧化酶抑制活性。此外，在蛋白质疏水性、电荷特性等方面，Ⅱ型CTLs与Ⅰ型CTLs存在明显差异，由此推测，Ⅱ型CTLs的功能可能不同于Ⅰ型CTLs，这有待进一步研究。

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