菟丝子总黄酮不同提取方法比较

秦晶晶 钱慧琴 赵媛

摘要 [目的]筛选菟丝子总黄酮的提取方法，为充分利用开发菟丝子总黄酮资源提供科学依据。[方法]采用回流提取法、冷浸法、超声提取法、微波辅助萃取法、索氏提取法5种方法提取菟丝子中总黄酮含量，以芦丁为对照品，通过紫外分光光度法对总黄酮的含量进行精密测定，对提取效率进行综合比较。[结果]5种提取方法所得总黄酮含量从大到小依次为回流提取法（31.24 mg/g）、微波辅助萃取法（16.84 mg/g）、索氏提取法（12.82 mg/g）、超声提取法（9.74 mg/g）、冷浸法（8.88 mg/g），回流提取法所得总黄酮含量最高。[结论]回流提取法应用于菟丝子总黄酮的提取，具有提取速度快、提取效率高的优点。

关键词 菟丝子；总黄酮；回流提取法；超声提取法；冷浸法；微波辅助萃取法；索氏提取法

中图分类号 S567.21 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）34-0114-03

Abstract [Objective] The research aimed to screen the extraction methods of total flavonoids in Cuscuta chinesis，and provide scientific basis for the development of total flavones resources in Cuscuta chinesis.[Method]Five kinds of extraction methods：reflux extraction method，cold maceration method，ultrasonic extraction method，microwave assisted extraction method and Soxhlet extraction method were used to extrant the content of total flavonoids in Cuscuta chinesis，rutin as a reference substance，the content of total flavonoids was determined by UV spectrophotometry，and the extraction efficiency was compared comprehensively.[Result]The content of total flavoniods gained by five kinds of extraction method was followed by：refluxing extraction method （31.24 mg/g）>microwave assisted extraction method （16.84 mg/g）> Soxhlet extraction method （12.82 mg/g）>ultrasonic extraction method （9.74 mg/g）>cold maceration method （8.88 mg/g），the content of total flavonoids was the highest by refluxing extraction method.

[Conclusion]The refluxing extraction method is applied to the extraction of Cuscuta chinesis total flavonoids，which has the advantage of extraction speed and high extraction effciency.

Key words Cuscuta chinesis；Total flavonoids；Refluxing extraction method；Ultrasonic extraction method；Cold maceration method；Microwave assisted extraction method；Soxhlet extraction method

菟丝子为旋花科植物南方菟丝子（Cuscuta australis R.Br.）或菟丝子（Cuscuta chinesis Lam.）的干燥成熟种子，味辛、甘，平，归肾、肝、脾经，具有补益肝肾、固精缩尿、安胎明目、止泻的功效[1]。经现代研究表明，菟丝子含黄酮类、多糖、木脂素等化学成分，其中主要為黄酮类成分[2-3]。有研究表明，菟丝子提取物在抗炎、抗肿瘤、抗衰老、调节免疫、壮阳等方面具有重要的药理活性[4-7]。近年来对菟丝子总黄酮提取工艺的研究有一些报道，一般采用回流提取法、超声提取法、冷浸法、微波辅助萃取法、索氏提取法、闪式提取等方法提取菟丝子中总黄酮[8-11]。笔者在前人研究的基础上，分别采用回流提取法、超声提取法、冷浸法、微波辅助提取法、索氏提取法5种方法来提取菟丝子中总黄酮，以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法（UV）测定菟丝子的总黄酮含量，以菟丝子总黄酮含量为指标，确定其最佳提取方法，为菟丝子中黄酮类化合物的提取提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材。菟丝子，购自安徽亳州市药材总公司，于60 ℃烘至恒重，经粉碎，过40目筛，备用。

1.1.2 仪器。电子分析天平（上海象平仪器仪表有限公司）、SG-4054型数控精密恒温水浴锅（上海硕光电子科技有限公司）、KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、R206型旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）、SHZ-3型循环水式真空泵（郑州杜甫仪器厂）、101-8型电热鼓风恒温干燥箱（江苏金坛市佳美仪器有限公司）、T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、WF-400 型微波快速反应系统（上海屹尧分析仪器有限公司）。

1.1.3 试剂。芦丁对照品，购自中国食品药品检定研究院（批号100080-201408）；95%乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH等试剂购于天津市德恩化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 供试品制备。

1.2.1.1 回流提取法。分别精密称取3份菟丝子粉末，每份约10 g，各置于500 mL圆底烧瓶中， 加入95%乙醇200 mL，水浴回流提取2次，每次2 h，过滤，对滤液进行合并，减压浓缩至少量，用95%乙醇将其转移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度。

1.2.1.2 超声提取法。分别精密称取3份菟丝子粉末，每份约10 g，各置于三角瓶中，加入95%乙醇 200 mL，80 ℃超声提取2次，每次30 min，过滤，对滤液进行合并，减压浓缩至少量，用95%乙醇将其转移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度。

1.2.1.3 冷浸法。分别精密称取3份菟丝子粉末，每份约10 g，第1次加10倍量95%乙醇，冷浸24 h，第2次加8倍量95%乙醇，冷浸12 h，过滤，对滤液进行合并，减压浓缩至少量，用95%乙醇将其转移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度。

1.2.1.4 微波辅助萃取法。分别精密称取3份菟丝子粉末，每份10 g，分别置于微波提取罐中，再各加入10倍量95%乙醇，80 ℃微波萃取2次，每次30 min，过滤，对滤液进行合并，减压浓缩至少量，用95%乙醇将其转移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度。

1.2.1.5 索氏提取法。分别精密称取3份菟丝子粉末，每份约10 g，各置于滤纸筒中，放入250 mL 索氏提取器中，各加入10倍量95%乙醇，加热提取4 h，过滤，对滤液进行合并，减压浓缩至少量，用95%乙醇将其转移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度。

1.2.2 不同提取方法中菟丝子总黄酮含量测定。

1.2.2.1 标准曲线的绘制。

称取在105 ℃下干燥至恒重的芦丁对照品25 mg，精密称定，用95%乙醇溶解，在50 mL容量瓶中定容至刻度，配成5 mg/mL芦丁标准溶液。分别精密吸取芦丁标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，各置于10 mL的具塞试管中，分别加水至 5.0 mL，然后再分别加入0.6 mL 5%亚硝酸钠，摇匀，放置6 min， 加入10%硝酸铝0.6 mL，摇匀后放置6 min，加入4%NaOH 3.0 mL，加水至刻度，摇匀后放置15 min。以第一管做空白对照，在波长506 nm处测定其吸光度A，以芦丁浓度 C （μg/mL） 为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，进行线性分析，求出回归方程，计算R2。

1.2.2.2 精密度试验。

分别精密吸取6份对照品溶液0.6 mL，按照“1.2.2.1”项下方法，在506 nm波长处测定吸光度A，计算RSD值。

1.2.2.3 稳定性试验。

分别精密吸取6份回流提取法供试品溶液0.1 mL ，分别于0、2、4、6、8、10 h，按照“1.2.2.1”项下方法，在波长506 nm处测定吸光度A，计算RSD值。

1.2.2.4 重复性试验。

分别精密吸取6份回流提取法供试品溶液0.1 mL ，按照“1.2.2.1”项下方法，在波长506 nm处测定吸光度A，计算RSD值。

1.2.2.5 加样回收率试验。

分别取“1.2.1.1”项下已知总黄酮含量 （31.14%） 的样品6份，各精密称取8 mg，按1∶1比例加入对照品，按照“1.2.2.1”项下方法，在506 nm波长处测定光光度A，计算RSD值。

1.2.2.6 样品总黄酮含量测定。

分别精密吸取“1.2.1.1”项下供试品溶液0.1 mL、“1.2.1.2”项下供试品溶液0.5 mL、“1.2.1.3”项下供试品溶液0.2 mL、“1.2.1.4”项下供试品溶液0.2 mL、“1.2.1.5”项下供试品溶液0.2 mL，置于10 mL具塞试管中，按照“1.2.2.1”项下方法，在波长506 nm处测定吸光度A，根據回归方程式计算出样品溶液中总黄酮的含量 （mg/mL），再根据样品的稀释倍数及质量换算出样品中总黄酮的含量 （mg/mL）。

1.3 数据统计分析 所有试验数据均为3次重复试验结果的平均值，数据统计分析采用SPSS 11.5进行，绘图采用Microsoft Excel 2007进行。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 标准曲线的绘制。以芦丁浓度C（μg/mL ） 为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线（图1），通过线性拟合得回归方程为A=0.07C+0.000 7（R2=0.999 9），表明芦丁浓度与吸光度具有良好的线性关系。

2.1.2 精密度试验。

按照“1.2.2.2”操作，测得6份芦丁标准品溶液的平均吸光度为0.415，计算RSD为0.44%（表1），表明该试验精密度良好。

2.1.3 稳定性试验。

按照“1.2.2.3”操作，6份菟丝子供试品溶液的平均吸光度为0.446，计算RSD为0.44%（表1），表明样品在10 h内稳定。

2.1.4 重复性试验。

按照“1.2.2.4”操作，6份菟丝子供试品溶液的平均吸光度为0.448，计算RSD为0.69%（表1），表明该试验重复性良好。

2.1.5 加样回收率试验。

菟丝子供试品溶液加样回收率试验结果见表2，计算平均加样回收率为99.25%，RSD为0.97% （n=6），表明该试验加样回收率良好。

2.2 不同提取方法中总黄酮的含量

按照“1.2.2.1”项下方法对“1.2.1”项下供试品溶液进行总黄酮含量测定，计算结果见表3。由表3可知，5种不同提取方法中菟丝子总黄酮的提取率由高到低依次为回流提取法（31.24 mg/g）、微波辅助萃取法（16.84 mg/g）、索氏提取法（12.82 mg/g）、超声提取法（9.74 mg/g）、冷浸法（8.88 mg/g）。由此可知，回流提取法的提取效率较高。

3 结论与讨论

采用5种不同的提取方法对菟丝子种子进行提取，菟丝子总黄酮的提取率由高到低依次为回流提取法、微波辅助萃取法、索氏提取法、超声提取法、冷浸法，可见回流提取法的提取效率较高。

冷浸提取法有效避免了加热过程，一定程度上保护菟丝子中的热敏性黄酮类成分，但是提取时间较长，所用溶剂量大，同时试验步骤比较繁琐。

超声提取法提取菟丝子中总黄酮，操作简单，提取工艺简单，试验条件易于控制，但是菟丝子中总黄酮提取率较低。

索氏提取法虽然效果也较好，但提取耗时，通常需要3～4 h ，而且长时间提取的话会因受热而容易导致样品结构破坏。

微波辅助萃取法提取效率仅次于回流提取法，虽然微波辅助萃取法它能直接作用于被加热物质， 加热速度快， 时间较短，一般完成提取只需30 min 左右，另外其样品分子结构不会破坏，是中草药有效成分提取的最佳方法。但设备昂贵，所需溶剂必须是有机溶剂，因此达不到经济节约的目的。

结合5种方法综合比较，回流提取法是菟丝子中总黄酮提取的最佳方法。该方法简便易行，且溶剂可回收利用，经济节约，提取率高，可适用于工业生产。

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