苹果多酚及其活性单体的提取·分离纯化及降脂效果研究

李新明 李群 高忠东 王峰田志芳 徐琳 王贤萍 刘森

摘要 [目的]分离并分析苹果多酚组分及活性单体纯度，并评价了它们的降脂活性。[方法] 利用乙醇提取苹果多酚，并分离纯化了4种（绿原酸、儿茶素、根皮苷、槲皮素）活性单体，采用高效液相色谱与质谱联用分析多酚组分及活性单体纯度，建立小鼠糖尿病模型。[结果]苹果多酚中绿原酸的含量是35.207%、儿茶素3.991%、根皮苷15.662%、槲皮素0.274%。4个活性单体成分（绿原酸、儿茶素、根皮苷、槲皮素），经过液相质谱分析，绿原酸的纯度是99.298%、儿茶素99.426%、根皮苷99.857%、槲皮素99.317%。动物试验表明，苹果多酚、绿原酸、儿茶素、根皮苷、槲皮素均能有效降低糖尿病鼠血总胆固醇（TG）、甘油三脂（TC）、低密度脂蛋白（LDL-c）水平，增加血高密度脂蛋白（HDL-c）水平。相比较苹果多酚，4种单体（绿原酸、儿茶素、根皮苷、槲皮素）均显示了更好的降脂活性。其中，根皮苷的降脂效果最好。[结论] 苹果多酚及活性单体有着较好的降脂活性。

关键词 苹果多酚；根皮苷；儿茶素；绿原酸

中图分类号 TQ914.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）13-0085-04

Extraction， Isolation and Purification of Apple Polyphenol and Its Active Monomers and Their Lowing-fat Effect

LI Xin-ming， LI Qun， GAO Zhong-dong et al

（Institute of Agricultural Products Processing， Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Taiyuan， Shanxi 030031）

Abstract [Objective] To evaluate the lowing-fat effect of apple polyphenol and its active components. [Method] Apple polyphenol was extracted using ethanol， and four active monomers （chlorogenic acid， catechin， phlorizin， quercetin） were isolated and purified. High performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry technology was used for analyzing components of apple polyphenol and purity of active monomers. A mice diabetes model was established. [Result] Apple polyphenol contained chlorogenic acid （35.207%）， catechin （3991%）， phlorizin （15.662%）， and quercetin （0.274%）. Purities of chlorogenic acid， catechin， phlorizin， and quercetin were respectively 99.298%， 99426%， 99.857%， and 99.317%. Animal experiments showed that apple polyphenol， chlorogenic acid， catechin， phlorizin， and quercetin could all effectively decrease blood TG， TC， LDL-c levels in diabetes mice， and increase HDL-c level. Compared with apple polyphenol， four active monomers （chlorogenic acid， catechin， phlorizin， quercetin） displayed stronger lowing blood fats effect. Among them， lowing blood fats effect of phlorizin was the best. [Conclusion] Apple polyphenol and its active components show good lowing-fat effect.

Key words Apple polyphenol；Phlorizin；Catechin；Chlorogenic acid

多酚為苹果中的主要功能活性成分，苹果多酚具有苯环并结合多个羟基化学结构，它主要包括黄酮醇、黄烷-3-醇、二氢查尔酮、羟基苯丙烯酸、花色素五大类。苹果多酚纯品为淡黄褐色粉末，略带苹果风味，稍有苦味，易溶于水和乙醇。苹果多酚具有多种保健功能（例如抗肿瘤、防高血压、抗突变、抗衰老、抗过敏、抗辐射等）[1]，因此，它可以被使用在功能性食品的开发研究上，对人们的身体保健有着重要意义。

绿原酸是一类苯丙素类化合物，近年来对绿原酸的研究较多，发现绿原酸具有降血脂、抗菌、抗炎、抗病毒、保肝利胆等方面的药理作用[2]。槲皮素是一种天然黄酮类化合物，多以苷的形式存在于植物的花、叶、果实中，研究证实，槲皮素具有扩张血管、降血压、降血脂、降低毛细血管通透性和脆性、防治冠心病等药理活性[3-4]。儿茶素类物质具有明显降低高脂血症小白鼠的血清总胆固醇（TG）、甘油三脂（TC）、低密度脂蛋白（LDL-c）和升高高密度脂蛋白（HDL-c）的作用[5-6]。根皮苷是从苹果、苹果树皮及叶等中提取而得，它是苹果树体内的酚类物质。根皮苷是由根皮素和配糖体为葡糖苷结合成的苷，它的降解产物根皮酚能有效抑制微生物活动的作用等[7-8]。国内外的临床研究表明，根皮苷在治疗糖尿病方面有很好的疗效。苹果多酚中含有这4种活性成分。

在该试验中，笔者提取了苹果多酚，并从中分离纯化了4种活性单体（根皮苷、儿茶素、槲皮素和绿原酸），同时评估了它们的降血脂效果。

1 材料与方法

1.1 原料

供试苹果为山西省太谷县产的红富士苹果。

1.2 苹果多酚的提取、纯化及分析

1.2.1 多酚提取和提取率。

准确称取200 g苹果，切碎，加入70%乙醇水溶液。在40 ℃温度下提取一定时间后抽滤。滤液转入500 mL容量瓶，定容，精密吸取样品液2.5 mL，置25 mL容量瓶中稀释10倍后，按没食子酸标准曲线制作法测定吸光度，计算多酚含量。

式中，C为测定液总酚浓度（μg/mL）；V为粗提液体积（mL）；N为稀释倍数；W为苹果原料重量（g）

1.2.2 苹果多酚的纯化。

试验路线：大孔吸附树脂预处理→多酚粗提浓缩液上柱吸附→水顶洗→乙醇溶液洗脱，收集洗脱液→真空浓缩→冷冻干燥→多酚纯化物。

1.2.3 苹果多酚的液相色谱及质谱分析。

对获得的纯化苹果多酚进行液相色谱及质谱分析，通过与标样比较分析，确定纯化苹果多酚的化学组成。

仪器型号：

Agilent 1100 液相色谱-质谱联用仪（LC-MSD-TRAP-XCT）。

1.2.3.1 液相色谱分析条件。

色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150.0 mm，5-Micron），流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈。梯度洗脱为0→7→15→30 min时，流动相B的用量依次为15%、15%、30%、50%；柱温30 ℃；检测器DAD（190～400 nm）；

检测波长280 nm；流速0.8 mL/min。

1.2.3.2质谱分析条件。

进样方式为液相色谱-质谱联用（LC-MS）；离子源为ESI；检测模式负离子；扫描范围50～800 m/z；离子源温度300 ℃；雾化气流速275.79 kPa；干燥气流速10 L/min；毛细管电压3 500 V；毛细管出口电压109 V；扫描方式auto MS/MSn。

质谱数据处理采用LC-MS Trap软件（5.2）版本分析质谱结果。

1.3 苹果多酚活性单体（根皮苷、儿茶素、槲皮素和绿原酸）的分离、纯化、收集和检测

称取上述纯化得到的苹果多酚10 g，用20 mL 97%乙醇溶解，用有机膜（0.45 μm）过滤，接着用95%乙醇以5 mL/min的流速上柱洗脱，用自动部分收集器开始收集洗脱液，紫外分光光度计在波长280 nm处在线检测洗脱液吸光值，并用高效液相色谱法（HPLC）对各峰的洗脱液进行检测，合并相同峰的洗脱液。低纯度馏分收集后作为层析原料再次纯化。旋转蒸发，浓缩、冻干，得到苹果多酚活性单体样品。

苹果多酚活性单体样品使用液相质谱法检测纯度。

液相色谱分析条件：仪器型号Agilent 1100 液相色谱-质谱联用仪（LC-MSD-TRAP-XCT）；色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150.0 mm，5-Micron）。

1.3.1槲皮素。

流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱：在时间0→5→15 min时，流动相B的用量依次为35%、35%、70%；柱温30 ℃；检测器为DAD（190～400 nm）；检测波长254 nm；流速0.8 mL/min。

1.3.2 根皮苷。

流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；洗脱A∶B为75∶25；柱温30 ℃；检测器为DAD（190～400 nm）；检测波长285 nm；流速0.8 mL/min。

1.3.3 绿原酸。

流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱：在时间0→12→20 min时，流动相B的用量依次为18%、18%、32%；柱温30 ℃；检测器为DAD（190～400 nm）；检测波长327 nm；流速0.8 mL/min。

1.3.4 儿茶素。

流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为甲醇；梯度洗脱：在时间0→5→18→22 min时流动相B的用量依次为20%、20%、50%、50%；柱温35 ℃；检测器为DAD（190～400 nm）；检测波长280 nm；流速0.8 mL/min。

1.3.5 质谱分析条件。

进样方式：LC-MS；离子源：ESI；检测模式：负离子；扫描范围 50～600 m/z；离子源温度300 ℃；雾化气流速275.79 kPa；干燥气流速10 L/min；毛细管电压3 500 V；毛细管出口电压109 V；扫描方式：auto MS/MSn。所有样品均配成约1 mg/mL，流动相溶解，过膜后，进样10 μL。

1.4 糖尿病小鼠模型的制备与分组

将KKAy小鼠随机分成4组，设非处理糖尿病对照组；药物处理组（低浓度组、中浓度组、高浓度组）。另10只C57BL/6J小鼠为正常对照组。

药物处理各组分别灌胃相应浓度的提取物（每天50 mg/kg体重、100 mg/kg体重、200 mg/kg体重），并饲喂高脂饲料；模型组每天饲喂高脂饲料并灌胃70 mg/kg体重蒸馏水，灌胃前最好为空腹。空白组每天饲喂正常饲料并灌胃70 mg/kg体重蒸馏水。连续进行70 d。试验结束时，取血以供生化指标测试。

1.5 生化指标测定

TG、TC、LDL-c、HDL-c分別使用它们的试剂盒测定，所有操作都按照试剂盒说明进行。

1.6 数据处理

用SPSS 12.0软件进行统计学处理，单因素方差分析检验组间显著性差异，各项指标以x±S表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

试验得出，苹果多酚提取率为4.79 mg/g。如图1所示，

苹果多酚中，绿原酸的含量是35.207%（保留时间4.089 min），儿茶素含量3.991%（保留时间6.164 min），根皮苷含量15.662%（保留时间16.921 min），槲皮素含量0274%（保留时间20.505 min）。 通过分离纯化，获得4个活性单体成分（绿原酸、儿茶素、根皮苷、槲皮素），经过液相色谱分析，绿原酸的纯度是99.298%，儿茶素纯度99.426%，根皮苷纯度99857%，槲皮素纯度99.317%（图2）。

2.1 药物对糠尿病鼠血TG水平的影響

如表1所示，与正常对照组相比，模型对照组TG水平显著升高，药物处理组TG水平均显著降低，且效果与剂量呈正比。各处理组相比，各剂量点根皮苷的干预效果最好，苹果多酚的效果最弱。

2.2 药物对糠尿病鼠血TC水平的影响

如表2所示，与正常对照组相比，模型对照组TC水平显著升高，药物处理组TC水平均显著降低，且效果与剂量呈正比。各处理组相比，各剂量点根皮苷的干预效果最好，苹果多酚的效果最弱。

2.3 药物对糖尿病鼠血LDL-c水平的影响

如表3所示，与正常对照组相比，模型对照组LDL-c水平显著升高，药物处理组LDL-c水平均显著降低，且效果与剂量呈正比。各处理组相比，各剂量点儿茶素的干预效果最好，苹果多酚的效果最弱。

2.4 药物对糠尿病鼠血HDL-c水平的影响

如表4所示，与正常对照组相比，模型对照组HDL-c水平显著降低，药物处理组HDL-c水平均显著升高，且效果与剂量呈正比。各处理组相比，各剂量点儿茶素的干预效果最好，苹果多酚和槲皮素的干预效果略次，且各剂量点两者的值相近，苹果多酚的效果最弱。

3 结论

该试验得出，苹果多酚中，绿原酸的含量是35.207%（保留时间4.089 min），儿茶素含量3.991%（保留时间6.164 min），根皮苷含量15.662%（保留时间16.921 min），槲皮素含量0.274%（保留时间20.505 min）。在该试验中，糖尿病组鼠血TG、TC、LDL-c水平显著升高，而HDL-c显著下降，这表明高脂饲料的饲喂能够提高小鼠的TG、TC、LDL-c含量，降低HDL-c含量。药物（苹果多酚、根皮苷、儿茶素、槲皮素、绿原酸）的饲喂能够降低血TG、TC、LDL-c水平，增高血HDL-c水平。由此说明，适量的药物（苹果多酚、根皮苷、儿茶素、槲皮素、绿原酸）对糖尿病可能有一定的防治作用。降低高血脂是预防和治疗糖尿病、心血管疾患的有效途径之一，综合分析数据表明，4种活性单体的降血脂效果均优于苹果多酚，而且根皮苷的效果最好，并呈现明显的量效依赖关系。研究结果为进一步开发利用苹果多酚及其活性单体提供了一定的依据。

参考文献

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