与小麦抗赤霉病基因连锁的分子标记（BARC133）检测

陈玉金

摘 要：小麦赤霉病是一种世界性的小麦病害，它不仅造成严重的产量损失，而且会降低籽粒的食用品质与种用价值。苏麦3号是目前国际公认的抗赤霉病的最佳抗源，该试验以苏麦3号为对照，利用SSR分子标记Barc133对180份试验材料进行DNA的提取、PCR扩增、聚丙烯酰胺电泳检测，推测可能含有抗赤霉病基因的小麦材料。

关键词：小麦；赤霉病；分子标记

中图分类号 S435 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）12-0035-03

Abstract：Wheat scab is a worldwide disease，which not only causes serious production loss，but also reduces grain consumption quality and seed value. Sumai 3 is recognized as the best anti-scab resistance source in the world. In this study，taking Sumai 3 as control，we tested 180 experimental materials based on the SSR molecular marker Barc133 by DNA extraction，PCR amplification and polyacrylamide electrophoresis technology，to detect the possible materials carried the resistance gene.

Key words：Wheat；Wheat scab；Molecular marker

小麦赤霉病又名麦穗枯、烂麦头、红麦头，是由多种镰刀菌引起的一种世界范围的麦类的严重病害[1]，其发生流行受土壤内菌源量、品种抗性及栽培管理措施等多种因素的影响，并且与气象条件关系密切，小麦抽穗扬花期如遭遇连续3d以上有一定降水量的阴雨天气，即可造成小麦赤霉病的发生。小麦感染赤霉病不仅容易造成严重减产，而且会使小麦的食用和种用价值显著降低，严重的甚至造成绝收。化学药剂防治小麦赤霉病，不仅易对环境造成污染而且农民实际操作起来十分麻烦。相比之下，培育抗赤霉病品种[2]是一种防治赤霉病经济且有效的方法，目前我国在小麦赤霉病抗病品种的选育方面处于世界领先水平[3]，赤霉病的抗性鉴定则是选育小麦抗病品种的重点环节。目前，虽然赤霉病的抗性鉴定有很多种方法，但由于小麦赤霉病抗性是由多对基因控制的数量性状[4，5]，其表现受生长条件和环境因素的影响很大，所以，仅仅靠抗赤性的表型进行目标性状的选择较为困难，不仅费时费力，而且育种效率不高，因而急需一种快速简便的鉴定方法。

近年来，随着现代基因技术的发展，国内外小麦育种专家学者针对各种小麦赤霉病抗源构建的遗传群体，尤其是微卫星（SSR）标记，因其数量丰富、多态性水平高、重复性和稳定性好而得到广泛的应用。通过SSR分子标记技术进行小麦赤霉病抗性QTL的分子定位[6]，并建立分子标记辅助选择系统，显著地提高了小麦抗赤霉病育种的效率。利用分子标记可在苗期就对植株进行抗病性检测，免受环境影响，节省了大量的人力物力。但是除了苏麦3号抗性主效QTL已被定位于3B染色体上，其紧密连锁的SSR标记Xgwm533和Xgwm493已得到公认外[7，9]，不同研究者对其他赤霉病抗性基因的定位（如Barc87、Barc133、Xgwm389）研究却有不同的结果。抗赤霉病品种宁894037的3BS上的SSR标记 Xbarc 133和Xgwm 493之间、抗赤霉病品种望水白的 3BS上的 Xbarc 147和 Xgwm 493之间、苏麦3号的 3BS上 Xgwm 533a与 Xgwm 493之间均存在 1个抗赤霉病主效 QT L[10，12]。

本研究拟用与小麦赤霉病抗性主效QT L紧密连锁的 SSR 标记 Xbarc 133来检测所收集的180份小麦材料，并通过6%变性聚丙烯酰胺凝膠电泳检测，以苏麦3号作为对照，推测可能含有抗赤霉病基因的小麦材料，在选育小麦品种时，可以以此为合理有效地利用抗赤霉病性强的亲本材料提供准确的信息，从而避免了育种和种植时产生不必要的浪费，为广大育种工作者和小麦种植户带来更多的效益。

1 材料和方法

1.1 材料 实验材料为安徽农业大学小麦育种实验室收集和保存的小麦种质材料，共计180份。

1.2 方法 抗赤霉病基因的分子标记检测

1.2.1 DNA的提取

1.2.1.1 试剂的配制 以下试剂皆采取以公认的国际标准配置（表1）。

1.2.1.2 SDS-Tris饱和酚法提取小麦DNA （1）取2～3粒粉粒粉碎后，放入离心管中，加700ulSDS提取液，50～60℃水浴45min，期间震荡6～8 次；（2）在离心机12000r下离心10min，然后吸600ul上清液，加600μL酚—氧仿—异戊醇于冰上颠倒混均15min；（3）在离心机12000r下离心10min，然后吸取500ul上清液，加入0.6倍的异丙醇（300μL）和1/10 倍（50ul）的NaAc（PH5.2）混均后于水上静置15min；（4）待絮状DNA沉淀出现，10000r，10min，弃上清液；（5）沉淀用70%的乙醇漂洗2遍，然后用无水乙醇漂洗1遍，室温下晾干，加入100μL 1×TE（或ddh2o）溶解，备用；（6）取7～8μL检测。

1.2.2 PCR扩增

（2）聚丙烯酰胺电泳检测：

①准备工作。首先把电泳玻璃板用去污剂清洗干净，晾干后，再用95%乙醇涂擦清洗玻璃板，然后再用亲水硅烷（Binding silane）均匀涂擦底板，在通风橱中用疏水硅烷（Repel silane）均匀涂擦耳朵板，待玻璃表面晾干，然后组装两块玻璃板，开始灌胶，注意灌胶速度保持电泳玻璃板水平，以防胶内产生气泡。胶灌完后再次调节电泳玻璃板水平，待胶凝聚45min或过夜，准备电泳。

②操作步骤。安装提前准备好的电泳玻璃板到电泳槽中，上下电泳槽均加1×TBE电极缓冲液约0.8L；首先进行预电泳：恒定功率80W，电泳10～30min；用吸耳球清除掉电泳玻璃板胶面沉积的异物和气泡，然后插入样品梳；在样品梳加样口加样约4～6μL，电泳约1h，恒定功率45～60W；固定电泳痕迹：用10% HAC溶液（可以继续留用作停显液），作用5～10min；冲洗电泳玻璃板胶面：用去离子水冲洗2次，2min/次；银染：1.5g AgNO3+1.5mL甲醛+1L蒸馏水配置溶液，作用20～30min；冲洗多余溶液：用去离子水快速漂洗1次（约2S）；显影：30g Na2CO3+ 1L water +1.5mL甲醛（现加）+200μL预冷硫代硫酸钠（10mg/mL，现加）；停显：10%HAC；冲洗：用去离子水冲洗1遍，然后室温晾干，照相保存。

2 结果与分析

利用已发表的与抗赤霉病基因紧密连锁的SSR标记（Barc133），通过基因组DNA提取-PCR扩增和6%变性聚丙烯酰胺凝胶对180份小麦材料进行检测，并与对照材料苏麦3号的电泳谱带对比，推测可能含有抗赤霉病基因的品种有宁麦9号、宁0076、Y14、50785、LD-10、LD-3、绵麦48。部分材料的检测图谱如图1所示。

3 讨论与结论

小麦赤霉病属气候型病害，田间抗性鉴定结果随外界环境的变化而有很大差异。在实验室利用与小麦抗赤霉病基因连锁的分子标记检测抗性基因在小麦品种或品系中的分布情况，避免了田间环境对实验结果造成的误差，使实验结果的可靠性大大提高，为抗性育种提供丰富的亲本的同时也加快了育种的进程。

本文利用分子标记Barc133所检测的具有抗赤霉病基因的材料有宁麦9号、宁0076、Y14、50785、LD-10、LD-3、绵麦48。因与小麦抗赤霉病基因QTL紧密连锁的SSR标记Xgwm493已得到公认[7，9]，因而本文将研究结果与Xgwm493所得结果进行对比。结果表明，两种标记共同检测到的材料仅有3份。从上述比较可知两者共有的抗赤霉病材料很少，而导致这一现象的原因主要是不同分子标记与抗赤霉病基因的连锁程度不同，造成不同分子标记检测的结果出现部分差异。但最终评判标准是与抗赤霉病基因的连锁程度越紧密，其鉴定出的结果越可靠，所以在实际小麦抗病育种中，检测结果可以为分子标记辅助育种提供参考，但不是绝对依据。

参考文献

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[12]Zhang X，ZhouMP，Ren LJ，et al.Molecular characterizati on of Fusarium head blight resistance fr om wheat variety Wangshuibai[J].Euphytica，2004，139：59-64. （责编：张宏民）