小桐子类固醇还原酶基因Jc5β-StR的克隆和表达分析

黄尧瑶文锦芬邓明华龚明陈浩维

（1. 昆明理工大学现代农业工程学院，昆明 650500；2. 昆明理工大学建筑与城市规划学院，昆明 650500；3. 云南农业大学园林园艺学院，昆明 650201；4. 云南师范大学生命科学院，昆明 650500）

小桐子类固醇还原酶基因Jc5β-StR的克隆和表达分析

黄尧瑶1文锦芬2邓明华3龚明4陈浩维1

（1. 昆明理工大学现代农业工程学院，昆明 650500；2. 昆明理工大学建筑与城市规划学院，昆明 650500；3. 云南农业大学园林园艺学院，昆明 650201；4. 云南师范大学生命科学院，昆明 650500）

以小桐子（Jatropha curcas L.）cDNA为模版，克隆了Jc5β-StR基因的CDS序列，并对其序列进行了生物信息学分析。序列分析表明该基因包含1 173 bp开放阅读框（ORF），编码390个氨基酸。预测其编码蛋白质的相对分子量为44.23 kD，理论等电点为5.22。Blast搜索结果及进化分析结果表明，Jc5β-StR与蓖麻5β-StR蛋白序列一致性最高（87%）且亲缘关系最近。Jc5β-StR是一个短链还原酶，该蛋白编码有一个短链还原酶家族（SDRs）的黄体酮5β还原酶（5β-POR），还含有SDRs的6个保守结构域。组织表达结果显示Jc5β-StR在小桐子根、茎、叶、花、果皮和种子中都有表达，在种子中表达量最高，且随种子发育过程表达量逐渐上升，在种子生长发育的后期（50 d）达到最高值后下降。非生物胁迫（PEG、NaCl、低温和机械损伤）诱导下，Jc5β-StR的表达量都不同程度上调，推测其参与小桐子非生物胁迫响应。

小桐子；Jc5β-StR；克隆；生物信息学分析；表达分析

短链还原酶家族（Short-chain dehydrogenases/ reductases，SDRs）是迄今为止发现的最古老、最大的蛋白质超家族之一，存在各种生物形式中，如古细菌，原核生物，真核生物和病毒等［1-2］。SDR家族成员在脂类、氨基酸、碳水化合物、激素类、异生物质代谢和氧化还原反应传感机制中发挥重要作用。它们通常催化NADP（H）依赖的反应，其底物包括多元醇、类维生素A、类固醇、脂肪酸的衍生物和异源物质等［3-4］。已报到的SDRs具有广泛的生物学功能，不仅通过参与许多重要内固醇化合物的合成来调控植物生长发育，如油菜素内酯和强心苷等，还参与植物的胁迫应答。半定量RT-PCR分析证实，在草莓果实发育过程中，草莓短链还原酶基因FaSDR的表达量随着果实的着色快速升高，揭示该基因可能参与草莓果实成熟调控［5］。拟南芥的一个短链还原酶基因AtHSD1通过调节油菜素内酯生物合成，来调控植物的生长和发育［6，7］。类固醇5α-还原酶（DET2）也属于SDR家族一员，是油菜素类固醇物质生物合成途径的限速酶，GbDET2基因在棉花纤维的起始和快速伸长过程中发挥着重要的作用［8］。从甘蓝型油菜中克隆的β-酮脂酰辅酶A还原酶基因BnKCR1和BnKCR2在植株中普遍表达，并在种子与根系中的表达最丰富，在酵母中异源表达这两个基因恢复了酵母脂肪酸延长酶的活性［9］。胡椒（CaMNR1）和拟南芥（AtSDR1）中的薄荷酮新薄荷醇还原酶（MNR）基因增强了植物对多种病原菌的抗性［10］。

类固醇5β还原酶5β-StR（3-o-Δ4，5steroid 5β-reductase）也是SDR家族的一员，能够催化多种类固醇基质，在内固醇化合物生物合成途径上发挥作用。目前对于植物5β-StR的研究报道较少，Herl等［11］在2009年报道了一个拟南芥内固醇5β还原酶基因At5β-StR，其蛋白序列和三维模型都与毛花洋地黄（Digitalis lanata）黄体酮5β还原酶（Dl5β-POR）相似度较高，5β-POR是一种类固醇化合物—强心苷生物合成途径上的重要催化酶。半定量RTPCR发现拟南芥At5β-StR在茎和根中表达量最高，并且在甘露醇诱导20 h后的表达明显增强，推测At5β-StR还参与植物渗透胁迫调控。同年，Edyta等［12］研究报道5β-StR因为其碳碳双键活性，所以催化能力要强于5β-POR。

小桐子（Jatropha curcas L.）又叫做膏桐、小油桐、老胖果、油芦子、麻疯树等。原产热带美洲，分布于我国广东、云南、四川、贵州、广西等省区［13］。小桐子果实含油率高达60%，可以提练出不含硫、无污染、符合欧四排放标准的生物柴油，是中国重点开发的绿色能源树种［14］。小桐子不择土壤，耐干旱瘠薄，又是干热河谷地区荒山造林的优良树种，具有广泛的开发利用前景［15-16］。本研究从小桐子中克隆得到一个类固醇5β还原酶基因Jc5β-StR，进行蛋白质序列和功能结构上的探讨，并分析其在不同组织和非生物胁迫下的表达变化，以期为进一步研究5β-StR基因的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料小桐子（Jatropha curcas L.）取自于云南省昆明市昆明理工大学现代农业工程学院实验基地。取小桐子根、茎、叶、花、果皮和授粉后不同发育阶段（10、20、30、40、50和60 d）的种子，立即液氮速冻后保存在-80℃的环境中备用。每种组织从10株小桐子树上取样，来源于3株树上的组织混合作为1个组织样品，4次重复。

实验处理材料为稳定成熟期的小桐子幼苗，取长势基本一致的小桐子幼苗分别放置于NaCl（250 mmol/L）培养液、30% PEG 6000培养液和4℃培养箱中，机械损伤用消过毒的剪刀在每个小桐子叶片上各剪5下，注意不要剪断叶片主脉。4种处理后的0（对照）、3、6、12和24 h取幼嫩的叶片。各处理3次重复，材料用锡箔纸包好，立即液氮速冻后保存在-80℃的环境中备用。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和cDNA第一链的合成 小桐子RNA用TianGen公司植物总RNA提取试剂盒（RNAprep pure Kit，DP432）提取，cDNA链合成用大连宝生物公司（TaKaRa PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）试剂盒，操作过程参考说明。产物放置于-20℃备用。1.2.2 基因克隆 Jc5β-StR基因克隆特异引物设计为Jc5β-StR-F（5'-CCTCAGCCACCAACTACTA-3'）和Jc5β-StR-R（5'-GTTCAAATCAAGGCACAAT-3'），PCR扩增用大连宝生物公司的Taq酶（TaKaRa Ex Taq Hot Start Version）和5×PCR buffer，cDNA模板加入量为2 μL，操作过程均参考说明。PCR反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环，72℃延伸5 min。将PCR产物连接到pMD18-T并双向测序，每个基因至少5个克隆。

1.2.3 cDNA序列及其编码氨基酸分析 用NCBI网站中的ORF finder找出基因的开放读码框（open reading frame，ORF）和其BLASTp程序进行同源性分析；用DNAMAN软件进行核酸翻译和多序列对比，采用MEGA7.0 Neighbor-joining方法构建进化树进行亲缘关系分析。利用ProtParam在线软件分析氨基酸残基数目、组成和蛋白质的基本性质等参数。利用ExPASy在线分析蛋白质一级结构和预测蛋白质功能位点。通过在线软件SOPMA预测蛋白质二级结构。用Modeling程序（http://swissmodel.expasy. org/）对蛋白质的三级结构进行预测。跨膜结构预测用TMHMM-2.0 server，信号肽预测用SignalP。

1.2.4 基因的表达分析 用实时荧光定量PCR方法进行基因表达分析。根据测序结果设计特异引物序列为Jc5β-StR-qF（5'-GATTTGCCCAGATTAGACGCT-3'）和Jc5β-StR-qR（5'-CAATCCCTCCTTCTTCGCTAC-3'）。内参基因序列设计为β-actin-F（5'-GCAGGCATCCACGAGACTACT-3'）和β-actin-R（5'-GTCAGCAATACCAGGGAACATAG-3'）。分别对反转录后不同组织和不同处理材料叶片cDNA进行实时荧光定量PCR分析。反应体系为：2 μL cDNA模板、12.5 μL Premix TaqTM、0.5 μL Jc5β-StR-qF、0.5 μL Jc5β-StR-qR、加dd H2O至25 μL。PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃预变性30 s，59℃退火1 min，72℃延伸30 s，72℃延伸5 min，35个循环。根据厂商推荐，在罗氏LightCycler 480系统上进行。每个材料做3次独立重复，采用2-ΔΔCT方法分析处理数据，在组织表达分析中用表达量最低的组织作为校正子，在种子发育过程中的时序表达分析用第一发育阶段（10 d）的样品做校正子［17］。用SPSS软件进行显著性分析，Excel 2013作图。

2 结果

2.1 Jc5β-StR基因的克隆

用RT-PCR方法对Jc5β-StR进行克隆，琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪上观察得到一条大约1 200 bp的产物（图1），对其测序后，用ORF finder软件分析Jc5β-StR基因编码氨基酸序列，完整的ORF框编码区为1 173 bp，编码蛋白包含390个氨基酸（图2）。

2.2 蛋白质一级结构分析

通过ProtParam软件分析表明，Jc5β-StR蛋白相对分子量为44.23 kD，理论等电点为5.22，酸性氨基酸残基总数（Asp+Glu）为49个，碱性氨基酸残基总数（Arg+Lys）为34个，不稳定系数为41.40，为不稳定蛋白。原子总数是6 160个，分子式为C2017H3032N520O578S13。脂肪系数为84.31，疏水系数为-0.299，为亲水蛋白。

2.3 蛋白质二级结构及三级结构分析

通过在线软件SOPMA对蛋白质进行二级结构预测，结果表明Jc5β-StR蛋白含有丰富的α螺旋（Alpha he1ix）占氨基酸残基总数的40.77%，其次是无规则卷曲（Random coil）占氨基酸残基总数的33.08%，延伸链（Extended strand）占氨基酸残基总数的17.18%，β-转角（Beta turn）占氨基酸残基总数的8.97%（图3）。

通过Prosite在线数据库分析，发现Jc5β-StR蛋白序列含有3类功能位点包括2个N-糖基化位点（N-glycosylation site），7个豆蔻酰化位点（N-myristoylation site）和7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（Casein kinase II phosphorylation site）。登录http://swissmodel.expasy.org/中的MODELING，对小桐子Jc5β-StR蛋白三级建模，结果显示Jc5β-StR蛋白质三级结构模型以黄体酮5β还原酶（5β-POR）为模板，序列相似度为74.86%，建模结果如图4所示。2.4 蛋白质亚细胞定位、跨膜结构和信号肽预测

图1 Jc5β-StR基因电泳检测图

蛋白质亚细胞定位预测Jc5β-StR最有可能定位在细胞质。跨膜结构预测结果表明Jc5β-StR不具有跨膜结构域。信号肽预测结果表明Jc5β-StR不具有信号肽，说明它不是一个分泌蛋白。

2.5 Jc5β-StR序列一致性分析

通过NCBI Blast序列比对发现5β-StR基因在多种植物中均存在，Jc5β-StR与大戟科蓖麻（Ricinus communis）序列一致性最高，为87%；其次与胡桃科核桃（Juglans regia）序列一致性为83%，与梧桐科可可树（Theobroma cacao）序列一致性为82%；与蔷薇科白梨（Pyrus bretschneideri）序列一致性为81%；与芸香科甜橙（Citrus sinensis）、锦葵科陆地棉（Gossypium hirsutum）、蔷薇科苹果（Malus domestica）和梅（Prunus mume）等序列一致性为80%；与大豆（Glycine max）、辣椒（Capsicum annuum）、油菜（Brassica napus）等其他几十种植物序列一致性为75%-79%。Jc5β-StR与不同种类植物序列一致性较高，说明该基因在植物进化过程中较保守。

图2 Jc5β-StR全长序列及其推导的氨基酸序列

图3 Jc5β-StR蛋白质二级结构

图4 Jc5β-StR蛋白质三级结构

Jc5β-StR属于NADB Rossmann超家族（图5）。该蛋白编码一个短链还原酶家族（SDRs）的黄体酮5β还原酶（5β-POR），Jc5β-StR也有含有SDRs的6个保守结构域（图6），表明Jc5β-StR是一个短链还原酶。结构域Ⅰ-Ⅲ在所有NADP依赖的SDRs中都存在，是典型的SDRs结构域，余下的3种Ⅳ-Ⅵ结构域，不是所有的SDRs都存在，特别是Ⅴ结构域（NFYYxxED），是5β-POR类的典型结构域［11］。

2.6 Jc5β-StR进化分析

用MEAG7.0软件对Jc5β-StR蛋白氨基酸序列和其他植物的5β-StR蛋白进行进化分析，结果表明，Jc5β-StR的进化基本符合植物分类学分类，并具有明显的种属特性，如属蔷薇科的苹果和梨组成一个分支，Jc5β-StR与大戟科蓖麻聚在一枝（图7），说明其与蓖麻亲缘关系最近。

2.7 Jc5β-StR表达分析

图5 Jc5β-StR保守结构域预测

图6 Jc5β-StR与不同物种5β-StR氨基酸序列对比

以β-actin作为内参，对小桐子Jc5β-StR在不同组织和种子不同发育阶段的表达情况进行qRT-PCR分析，分析结果表明，Jc5β-StR在小桐子根、茎、叶、花、果皮和种子中都有表达，在种子和叶片中的表达量显著高于其他组织。Jc5β-StR在种子发育过程中的定量分析（图8）表明，该基因在种子整个生长发育期都有表达，在种子生长发育前期其表达水平不断增加，在种子生长发育的后期（50 d）达到最高值，然后下降。

Jc5β-StR在PEG、NaCl、机械损伤和低温4℃处理下表达都不同程度提高，PEG处理下表达水平变化显著，在第12 h达到最高值，为对照样品表达量的6倍左右。NaCl处理下12 h达到最高值，为对照样品的1.8倍左右。机械损伤处理下第6 h达到最高值，为对照样品的3.7倍左右。4℃处理下Jc5β-StR在第3小时表达水平就达到最高值，为对照样品的2.5倍左右，之后缓慢下降（图9）。

图7 不同植物5β-StR氨基酸序列进化树分析

3 讨论

本研究通过RT-PCR方法从小桐子中克隆了一个小桐子类固醇5β还原酶基因（Jc5β-StR），分析其ORF大小为1 173 bp，编码蛋白包含390个氨基酸。预测其相对分子量为44.23 kD，理论等电点为5.22。蛋白质亚细胞定位预测其定位在细胞质，没有跨膜结构域，也不具有信号肽。Blast结果表明Jc5β-StR属于NADB Rossmann超家族。其序列与同属于大戟科的蓖麻5β-StR序列一致性最高，为87%，进化树分析表明其与蓖麻5β-StR亲缘关系最近。该蛋白编码一个短链还原酶家族（SDRs）的黄体酮5β还原酶（5β-POR），也含有SDRs的6个保守结构域，证明Jc5β-StR是一个短链还原酶。

图8 Jc5β-StR基因在不同组织（A）和种子不同发育时期（B）的表达

图9 小桐子Jc5β-StR基因在不同非生物胁迫处理下的表达

类固醇化合物对植物生长发育过程具有调节作用，Mandava报道了甾和皂苷对某些植物的生长过程均有调节作用，特别是甾醇和性激素对一些植物的生长具有促进作用［18］。种子作为小桐子的生殖器官，在发育过程中大量合成和累积类固醇化合物，结合本实验定量分析结果，Jc5β-StR在小桐子种子中高表达，并且在种子生长发育期表达量上升，种子成熟期（50 d）表达量达到最高值后下降，表达量变化过程与种子生长发育趋势一致，进一步验证了5β-StR在类固醇化合物生物合成途径上的重要作用。保守结构域预测还表明Jc5β-StR也属于SDRs家族一员，已报到的SDRs广泛参与植物的初级代谢和次级代谢，在植物生长发育和抗逆机制中发挥重要作用［5-11］。本研究小桐子幼苗在PEG、NaCl、机械损伤和低温这4种非生物胁迫处理下Jc5β-StR基因表达量都不同程度上调，由此推测Jc5β-StR也参与小桐子非生物胁迫应答。本研究为深入了解5β-StR基因的功能和小桐子的抗逆机制奠定了基础。

4 结论

本研究报道了小桐子的一个内固醇5β还原酶基因 Jc5β-StR。序列全长1 173 bp，编码390个氨基酸。该基因编码的蛋白含有SDRs的6个保守结构域。Jc5β-StR具有组织表达特异性，在种子中表达量最高，还受多种非生物胁迫诱导上调表达。

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（责任编辑 狄艳红）

Cloning and Expression Analysis of Jc5β-StR Gene in Jatropha curcas

HUANG Yao-yao1WEN Jin-fen2DENG Ming-hua3GONG Ming4CHEN Hao-wei11. Faculty of Modern Agricultural Engineering，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500；2. Faculty of Architecture and City Planning，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500；3. Faculty of Landscape and Horticulture，Yunnan
Agricultural University，Kunming 650201；4. School of Life Sciences，Yunnan Normal University，Kunming 650500）

The CDS sequence of Jc5β-StR gene was cloned with Jatropha curcas cDNA as template，and analyzed by bioinformatics analysis. The opening reading frame（ORF）of Jc5β-StR was 1 173 bp encoded 390 amino acids. The predicted molecular weight was 44.23 kD，and theoretical isoelectric point（pI）was 5.22. Blast searching and phylogenetic analysis showed that Jc5β-StR had highest identity（87%）and closest relationships with the 5β-StR of Ricinus communis. Jc5β-StR was a short-chain reductase，containing a progesterone 5β reductase（5β-POR）in a family of short chain reductase（SDRs），and also 6 conserved domains of SDRs. Jc5β-StR expressed in different tissues of root，stem，leave，flower，seed capsule，and seed，the 1highest in seed；moreover，the expression gradually rose with the development of seed，and declined after peak in the later stage of seed development（50 d）. The abiotic stress such as NaCl，PEG，4℃，and mechanical damage resulted in the up-regulation of Jc5β-StR expression in varied level，indicating that Jc5β-StR involved in the response to abiotic stress.

Jatropha curcas L.；Jc5β-StR；clone；bioinformatics analysis；expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1114

2016-12-08

国家自然科学基金项目（31460355）

黄尧瑶，女，硕士研究生，研究方向：分子生物学；E-mail：358680047@qq.com

文锦芬，博士，副教授，研究方向：植物次生代谢产物；E-mail：wenjf888@163.com