转移因子的组成和作用机制研究*

2017-07-12秦卓明徐怀英黄迪海董玉兰刘霞盛晓丹郭卉杨波秦春芝张再辉

家禽科学 2017年7期

秦卓明，徐怀英，黄迪海，董玉兰，刘霞，盛晓丹，郭卉，杨波，秦春芝，张再辉

（1.山东省农业科学院家禽研究所，山东济南250023；2.山东省健牧生物药业有限公司，山东济南250100；3.济南市动物生物药品工程技术研究中心，山东济南250100；4.中国农业大学动物医学院，北京100094）

转移因子的组成和作用机制研究*

秦卓明1,2,3**，徐怀英1，黄迪海2,3，董玉兰4，刘霞2,3，盛晓丹2,3，郭卉2,3，杨波2,3，秦春芝2,3，张再辉2,3

转移因子（Transfer Factor，TF）是白细胞中具有免疫活性的T淋巴细胞所释放的一类可透析和传递“信使”小分子物质，它携带有致敏淋巴细胞的特异性免疫信息，在受者体内能够诱导T细胞转变为致敏性淋巴细胞，并能够特异地将供者的细胞免疫力被动的转移到受者体内，使受者获得细胞免疫功能，即转移和扩大细胞免疫力。

转移因子；生物学活性；机制

TF属多肽类物质，又称免疫小肽，也称传输因子，是白细胞透析物（DLE）之一，含多种氨基酸，分子量在10000道尔顿（Da）以内，无热原，无抗原性，无毒副作用和无种属差异，携带有致敏淋巴细胞的特异性免疫信息，能够将免疫信息递呈给受体淋巴细胞，使受体无活性的淋巴细胞转变为特异性致敏淋巴细胞，从而激发受体细胞介导的免疫反应，是一种新型而又安全的细胞免疫增效制剂[1]，广泛应用于人与动物病毒病、细菌病、真菌病和寄生虫病等的防控[2]。

1 历史和发现

1949年，Lawrence发现，来自结核菌素试验阳性的淋巴细胞处理试验阴性的受者，能使结核菌素试验阴性的受者转变成为阳性。Lawrence（1955）进一步研究发现白细胞可透析物具有同样的功能，并把引起这种效应的物质称之为转移因子（Transfer Factor，TF）[3-4]。在随后的六十多年中，众多科技工作者对其进行了大量的研究。Bloom（1967）将人的迟发超敏反应转移给豚鼠；Maddison（1972）将人的结核菌素超敏反应转移给猴；Klesius（1977）将牛的白喉类毒素迟发超敏反应转移给家兔；Burger（1979）证明牛转移因子可以把钥孔血蓝蛋白（KLH）的特异性免疫从牛转移给未接触过这种抗原的人体。众多的事实证明：TF是在种系发育中保存下来的，只要有白细胞就会有转移因子，不存在种间差异。Kirkpatrick（2000年）发现TF具有保守序列“LLYAQDL/VEDN”，该序列能够与靶细胞表面受体结合，阻碍特异性TF的免疫传递。

2 转移因子的分类[5-7]

2.1 依据TF产生的时间和方式初步分为三类，包括前体TF（TFpre）、分泌型TF（TFsec）和膜结合TF（TFmem）。其中，TFsec通过细胞膜分泌，可能是细胞间信使；TFmem为膜结合TF。所有TF的肽链与RNA链的连接，都是通过肽链N端和RNA的5′磷酸根连接起来的。

2.2 依据对动物的免疫反应TF有特异性和非特异性之分。按致病微生物可分为病毒性特异TF、细菌性特异TF和寄生虫特异TF。特异性转移因子采用某种特定病原感染或免疫人群和动物后再提取含该抗原特异活性的转移因子。非特异性转移因子是指用自然人群或动物白细胞提取的具有多种免疫活性的转移因子。前者具有对特定疾病的局限治疗，后者则应用广泛。

2.3 依据动物来源中国第四届转移因子会议（1990）根据材料等级（从高级到低级）对TF统一分类和命名。第一类为人TF；第二类为兽TF；第三类为禽TF。具体包括人TF（HS-TF）、猪TF（PSTF）、牛TF（BS-TF）、羊TF（SS-TF）和鸡TF（CSTF）等。

2.4 其它依据制备TF的组织来源，可将TF分类，包括脾转移因子、胎盘转移因子和白细胞转移因子等。

3 转移因子的组成

转移因子是存在于人和动物免疫淋巴细胞内的、可透析的小分子物质，成分复杂，其化学本质是由多肽和寡核苷酸组成，不含蛋白质的的杂合分子，分子量一般小于10000Da，能自由通过半透膜。粗制TF是小分子多肽和多核苷酸物质，一般含有K、Na、Ca、Mg、Zn等金属元素，多核苷酸含核糖和碱性腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶以及6种以上氨基酸，等电点为4.48，其多肽部分富含天冬氨酸，肽链N末端可能封闭。粗制的TF，总氨基酸包括游离氨基酸和组成多肽的氨基酸，游离氨基酸占总氨基酸的2/3，组成多肽的氨基酸占总氨基酸的1/3，TF中多肽与小分子RNA比例为2：1。

黄迪海（2014）等[8]通过福林酚法测定鸡脾转移因子口服溶液多肽含量为1570.8μg/ml，SDSPAGE电泳法测得多肽的分子量为9213Da，脱E受体法测定鸡脾转移因子活力为10.92%，LC-MS法测得多肽分子量为800～7476Da，共581种多肽，其中包括T细胞凋亡抑制相关蛋白（TIAL1）等多种生物活性蛋白（详见表1和表2）。

表1 鸡脾转移因子通过非酶切方式获得的具有代表性的多肽

表2 鸡脾转移因子通过酶切方式获得的具有代表性的多肽

4 转移因子的生物学特性

4.1 理化特征转移因子为小分子肽，具有热不稳定性，对紫外光有吸收，最大吸收光波为230～ 280nm，平均值为250nm，无热原，56℃30min即可被灭活，但活性不被胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、DNA酶和RNA酶破坏，-20℃以下可保存数年而活性不变。经23、37℃处理3个月后的TF与在4℃环境温度下贮存的TF相比较，其对淋巴细胞增殖的影响无明显差别，但经56℃处理30min后，其活性基本消失。

4.2 种属差异不同动物种类的TF组份差异不大，但含量有所不同。以Sephadex G-25进行柱层析为例，一般哺乳动物脾脏小分子活性物质提取物可得到3～6个峰，鸡脾脏小分子活性物质提取液层析后可得到3个组分，其中组分l的多肽含量高，组分2、组分3中核苷酸含量高。水解人、猪、牛的TF可得到18种氨基酸，其中谷氨酰胺含量最高，精氨酸和天门冬氨酸次之。鸡脾脏小分子活性物质提取液的活性组分中甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸含量较高，Sephadex G-25柱层析各组分均含有甘氨酸、丝氨酸，且各组分免疫活性的强弱与这两种氨基酸的浓度呈正相关。

4.3 生物学活性

4.3.1 抗原性首先，TF不是抗原，不具有免疫原性。主要原因在于其分子量偏小，一般介于2000～10000Da（一般说来，只有分子量大于100000Da的蛋白才具有抗原性），最多只能算是半抗原，单独靠其本身是很难发挥免疫原性的。如高应答动物提取的TF，能引起低免疫应答发生迟发超敏反应，反之，则不能。也就是说，TF无抗原性存在。但是，TF具有抗原特异性，如给动物免疫不同的抗原，动物脾脏可产生针对免疫原的特异性转移因子。例如，给鸡群免疫新城疫，利用免疫鸡脾脏制备的转移因子对治疗鸡新城疫有特殊的效果。

其次，TF反应速度快。注射TF后，4～8h可使受者发生迟发型过敏反应，而用抗原免疫，即使抗原量很大，也必须在72h才能产生反应。因为任何免疫反应都必须激活体内的免疫系统，尤其是特异性免疫系统，包括针对性的细胞免疫和体液免疫等。而TF则因分子量太小，不属于抗原，可直接可被体内吸收，不能产生相应的抗体。

4.3.2 其它生物学特征大量的研究证实：TF无种属特异性；1个TF单位相当于108个白细胞；TF致敏淋巴细胞剂量小，0.01个TF单位即可发生反应；TF作用时间快：一般8～24h，最快4h即可激活宿主淋巴细胞；人的TF持续时间长，一般在1年以上。当然，对于寿命较短的家禽来讲，TF在家禽体内维持的时间尚无定论。

4.4 药效动力学TF能抵抗消化酶(如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等)及核酸酶(DNA酶和RNA酶)，在胃肠道内不被破坏，且能以原型吸收。这表明，TF即可注射，又可口服，还可饮水。

姜训等（1994）[9]报道口服TF主要经上消化道吸收，在血液、肝脏及尿中TF高峰时间分别为2h、8h及24h。陈德坤等（2001）[10]分别给成年健康小鼠口服和注射不同剂量的TF，结果表明，无论是口服还是注射TF，均可使小鼠外周血中性粒细胞和腹腔巨噬细胞的吞噬率提高，并且在一定范围内，其吞噬率的高低与TF剂量呈正相关。李丛壁等（1997）[11]报道口服和注射TF在促进腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞比率、迟发型变态反应方面无明显差异。马红等（1997）[12]报道制成口服脂质体TF，口服与注射TF在促进机体免疫功能方面具有同等效果。

TF口服和注射用药后均效果显著，这一特性极大地方便了TF在兽医临床尤其是集约化养禽生产中的推广应用。

4.5 与弱毒活疫苗的比较TF和弱毒活疫苗都是具有生物活性的物质，均可以增强动物的免疫保护力。二者的区别在于，前者是广谱性的，后者是特异性的，二者具有本质的差别。详细差别可参见表3。

5 转移因子的作用机理

转移因子是一种免疫“信使”，是一种细胞因子，其对宿主的免疫调节机制是多元化的，尚有很多机制仍处于不断地探讨之中，其作用路径详见图1。主要的免疫调节机制如下：

图1 转移因子对宿主的免疫调节机制

5.1 T细胞激活机制

5.1.1 第一种理论推测一般来说，T细胞激活通常需要识别自身的MHC抗原和异种抗原，而TF不含有抗原。最近的研究发现，在50%外周循环的淋巴细胞表面有DNA存在，很可能是TF上的寡核糖核苷部分与表面DNA结合，再通过DNA受体进入胞内，被裂解了的TF肽段则留在表面成为抗原受体的一部分，这样一来，未被激活的T细胞就成了特异性T淋巴细胞，能够发生继发性免疫反应。由于T细胞自己能形成受体，因此，TF对T细胞的激活不是必须的，但它能提高机体免疫力，使机体在受抗原侵入时，能直接发生继发性免疫反应。支持这一理论的依据是：一是寡核糖核苷与细胞表面DNA的结合是完全可能的，而且这种传递方式对细胞而言比较容易发生；二是TF可以与抗原作用有关，而与抗体无作用。那么，至少TF与抗原受体有关，可以作为抗原受体的一部分。

5.1.2 第二种理论推测T细胞与TF“接触”后，T细胞表现出抗原受体的变构，或膜结构的改变，以致形成新的TF受体来接受TF的免疫信息，这可能是TF受体肽段与受体蛋白分子间化学键相互作用的结果。至于TF与T细胞接触引起的变构机制，目前还不清楚。

5.2 非特异性免疫

5.2.1 巨噬细胞吞噬活性提高在有抗原成分存在的情况下，TF可通过传递抗原信息、激活细胞受体、诱导活性因子合成等机理活化各种免疫细胞；而在缺乏抗原成分的条件下，TF则通过促进细胞mRNA的合成及与细胞膜受体结合导致淋巴细胞活化。研究表明，TF可增强巨噬细胞抗原递呈作用，诱导干扰素产生等。研究结核特异性TF时发现其能增强巨噬细胞的抗原递呈作用，并且与TF浓度呈一定的相关性。

5.2.2 增强粒细胞趋化功能TF对中性粒细胞具有很强的趋化活性，对巨噬细胞也有弱的趋化活性；能增加单核细胞浓度，增强K细胞的杀伤活性。研究表明，TF可以促进多形中性粒细胞游走活性。可以提高淋巴细胞的转化率增强免疫效果；另外具有促进胸腺细胞分化作用，从而对机体产生免疫调节。

5.2.3 提高细胞因子水平，产生干扰素TF可诱导靶细胞分泌白介素、干扰素、淋巴因子、趋化因子、肿瘤坏死因子等，促进信息传导功能，从而进一步提高免疫效果。

5.2.4 诱导淋巴细胞产生，增强抗氧化能力，促进机体的免疫反应董玉兰（2015）等连续灌服中高剂量鸡脾转移因子一周后，鸡的肠绒毛高度显著升高，肠隐窝深度显著降低，V/C比值显著升高，改善肠粘膜结构；并显著增加小肠粘膜屏障的杯状细胞数量，显著上调Muc2基因的相对表达量；停药一周后免疫器官发育显著优于对照组，肠粘膜形态结构显著好于对照组，杯状细胞的数量显著高于对照组，但对Muc2基因的上调作用相对减弱。进一步的研究发现：连续灌服中、高剂量TF一周后，还可显著升高各肠段上皮内淋巴细胞数量、IL-10含量，显著降低TNF-α含量，增强各肠段抗氧化酶（SOD、GSH-PX、CAT）及总抗氧化能力，并且能显著降低各肠段MDA的含量；有助于自由基的清除；进一步促进机体的免疫反应。停药一周后，仍有显著影响。连续灌服1周中高剂量（0.25～1.00ml）TF显著上调TLR-2、TLR-4基因的相对表达量；停喂一周尽管上调作用有所降低，但仍高于对照组。这一实验证实了鸡TF具有提高家禽非特异性免疫功能。

5.3 增强细胞免疫功能早期经典的TF机理研究试验就发现TF具有传递特异细胞免疫信息的活性，而抗原信息的刺激与动物机体免疫功能的发挥有着直接的联系[1]。已有资料证实，TF可激活淋巴细胞E受体，增加E玫瑰花结的形成数目。因此免疫信息通过TF转移给受体淋巴细胞，使细胞获得这种免疫信息而产生识别特异性抗原的受体，当有该种抗原存在时，这种特异性识别受体就会与特异性抗原结合而触发受体细胞活化，从而增强淋巴细胞的活性而导致其高度分化增殖。

研究表明，作为免疫增强剂，TF进入机体后可使造血系统迅速产生大量的白细胞，并活化淋巴细胞，从而促进Th细胞的产生，进一步促进T淋巴细胞分化增强机体的免疫功能。一些研究表明TF可以增强体内的细胞免疫和/或转移信息来识别并诱导针对各种病原的新的免疫应答，因此认为利用TF不仅可以作为一种治疗和预防病原感染的手段，甚至可以应用于肿瘤的治疗与预防。有研究证实：同时注射新城疫I系疫苗和鸡脾TF，免疫鸡的淋巴细胞转化率明显高于单独免疫疫苗组。另外有研究利用HIV特异性TF与抗HIV药物齐多夫定进行对比，对20个HIV感染无明显症状且淋巴结持续肿大的患者随机分为两组，一组接受齐多夫定治疗，另一组为齐多夫定与HIV特异性TF同时治疗六个月，含TF治疗组患者血细胞、CD8淋巴细胞和IL-2水平升高，推测HIV特异性TF活化了Th1类细胞因子模式。

黄建文等（2003）[13]的试验表明，利用鸡传染性喉气管炎灭活疫苗免疫鸡，同时肌注TF，可使淋巴细胞转化率升高，这表明鸡的细胞免疫机能增强。鸡脾TF和新城疫I系苗联合使用可显著提高淋巴细胞的转化率。此外，彭贵勇等（1993）[14]报道TF可降低丝裂霉素对淋巴细胞转化的抑制作用，可协同5-氟脲嘧啶显著增加淋巴细胞转化率。

5.4 增强体液免疫研究者普遍认为TF调节机体体液免疫是通过作用T淋巴细胞调节机体的细胞免疫来实现的。TF作为免疫激活剂进入机体后，可使造血系统在短期内产生大量的白细胞，同时活化淋巴细胞，增加T辅助细胞产生和释放更多的淋巴因子，促进T淋巴细胞生长和分裂，从而发挥抗放射、抗免疫抑制、增强免疫功能的作用。高迎春等（2001）[15]将TF注射至鸡体后再接种减蛋综合征灭活疫苗，与对照组相比可显著提高免疫鸡的抗体滴度。史秀山等（2000）[16]将TF与狂犬病疫苗联合免疫小鼠，较单独免疫狂犬疫苗的小鼠抗体效价显著增高，且抗体效价维持时间更长。许多重要的临床研究表明，病毒特异性TF可以预防病毒感染，Khan等利用未知的抗原特异性TF治疗17位疱疹病人获得了令人鼓舞的结果。鸡脾TF与新城疫活疫苗配合接种雏鸡，接种28d后，试验组抗体达到峰值，与对照组差异显著。

5.5 促生长作用研究表明TF在机体生长发育方面具有促进作用。其机理是：动物机体的正常生长发育一般由T4、T3和GH协同调控而完成。GH主要促进组织生长，T4、T3主要促进器官、组织的分化，而且，GH的促生长作用，需要有适量的T4、T3的存在。目前猜测TF在动物生长发育过程中发挥的作用机制与血液中T4、GH水平的升高有一定联系。

实验证明，按推荐剂量与疗程应用TF，育成羊体重可增加3.17kg，新生羔羊初生重增加0.24kg；奶牛提高产奶量8.71%；仔猪初生重增加0.1296kg；肉仔鸡平均日增重增加3.10g。此外，母鸡提高产蛋率4%～8%；仔鸡腹泻率降低6%；雏鸡成活率提高3%～5%。

5.6 解除免疫抑制在肿瘤治疗过程中，用特异性TF免疫治疗肿瘤患者，检测细胞因子活性均显著增强，与化疗患者相比体内IL-1、IL-2活性及WBC显著增高。由此可见，TF可以作为免疫调节剂用于调节肿瘤患者的细胞因子水平。

对于家禽而言，导致家禽发生免疫抑制的原因很多，但主要的是病原性微生物，尤其是病毒性疫病，如禽网状内皮增生症病毒（REV）、传染性贫血因子病毒（CAA）、传染性法氏囊病毒（IBD）、禽白血病病毒（ALV）、呼肠孤病毒（REO）、传染性腺病毒（ADO）、低致病性禽流感病毒等，上述病毒可直接或间接损害免疫器官如胸腺、法氏囊、骨髓等，而TF可活化淋巴细胞，增加T辅助细胞产生和释放更多的淋巴因子，促进T淋巴细胞生长和分裂，从而激发更多的细胞和体液免疫功能，显著降低鸡群的免疫抑制。

5.7 解毒和抗菌功能TF可提高肝脏细胞的解毒功能，并促进肝细胞的修复与自愈。这是因为TF增强了肝细胞吞噬、吸收、聚集与排泄功能，并增强了肝脏本身的免疫功能，在其它功能细胞组织的协同作用下，提高对毒物的解毒作用。抗菌抗病毒机理：TF的抑菌谱相当广泛，推测与其自身含有抗菌肽等物质有关。但在普通的条件下，TF的抑菌圈很小，甚至不显现，只有在高浓度时，才有抑菌圈。TF在体内的抗病毒作用表现为多效性，主要是通过提高宿主自身的免疫系统来提高机体自身的抗病毒能力。

5.8 抗肿瘤和细胞趋化作用Levin（1982）曾制取人骨肉瘤特异性透析液治疗6例患者，避免了肿瘤转移；Mrazova（1986）等用同癌症病人生活在同一环境中的家庭成员的白细胞制取透析液，其疗效较商品透析液高。不过，用有特异免疫力的人白细胞制备透析液，只能少量生产，为少数人治疗，而免疫动物提取制剂却是个突破。TF抗肿瘤机理是诱导免疫细胞产生肿瘤坏死因子并激活免疫细胞直接杀伤肿瘤细胞，且TF对中性粒细胞、巨噬细胞具有很强的趋化作用，促进多形核细胞、中性粒细胞游走，刺激巨噬细胞产生淋巴细胞激活因子，诱导巨噬细胞产生干扰素。

[1]孙卫民，王惠琴．细胞因子研究方法学[M]．北京：人民卫生出版社，2001.

[2]李鑫．转移因子的研究进展[J]．畜禽业，2010，(254)：38-40.

[3]Lawrence H S.Transfer Factor[J].Advan Immunol,1969,(2):195.

[4]Lawrence H S.The transf er in human of delayed skin sensitivity to Streptococcal M Substance and to tuberculinwith Disrupted Leucocytes[J].Clin Invest,1955,(34):219.

[5]钱微，程昌．转移因子的部分生化和免疫性及其应用[J]．畜牧兽医学报，1994(4)：317-322.

[6]付旭彬，张少华，李守军．脾脏转移因子的研究进展[J]．畜禽业，2003(7)：10-11.

[7]郭成留，程会昌．动物转移因子及其研究进展[J]．河南农业科学，2003(6)：46-48.

[8]黄迪海，刘霞，盛晓丹，等．兽用鸡脾转移因子的多肽组成研究[J]．中国兽药杂志，2014，48(2)：23-27.

[9]姜训，赵革平，马焱，等．口服转移因子体内动力学的初步观察[J]．中国生物制品学杂志，1999（04）：151-152.

[10]陈德坤，覃勇，吴辉，等．猪脾转移因子对小鼠吞噬细胞吞噬功能的影响[J]．动物医学进展，2001，03 (022)：77-79.

[11]李丛壁，方天祺，齐文川．口服与注射用转移因子的体内外免疫活性比较[J]．中国生物制品学杂志，1997，(02)：91-93.

[12]马红，梁俊峰，吴洁，等．口服脂质体转移因子的制备及其活性[J]．中国生化药物杂志，1997，18(3)：109-111.

[13]黄建文，何维明，姜艳芬，等．转移因子对鸡传染性喉气管炎灭活疫苗作用的研究[J]．西北农业学报，2003（01）：100-102.

[14]彭贵勇，袁爱力，蔡景修．转移因子、丝裂霉素、5-氟脲嘧啶对淋巴细胞转化的影响[J]．上海免疫学杂志，1993(03)：160-161.

[15]高迎春，李相安，徐恩民，等．鸡脾转移因子对体液免疫影响的研究[J]．山东畜牧兽医，2001（4）：8.

[16]史秀山．转移因子增强狂犬病疫苗免疫效果的研究[J]．中国人兽共患病杂志，2000，20(11)：987-989.