陆地棉编码成花素同源基因GhFT1-A和GhFT1-D启动子的克隆及活性分析

蔡大润，李超，黄先忠*

（石河子大学生命科学学院/特色植物基因组学实验室，新疆 石河子 832003）

陆地棉编码成花素同源基因GhFT1-A和GhFT1-D启动子的克隆及活性分析

蔡大润，李超，黄先忠*

（石河子大学生命科学学院/特色植物基因组学实验室，新疆 石河子 832003）

在陆地棉全基因组中序列比对GhFT1基因在At和Dt基因组上的差异，设计特异性引物克隆其上游约1.8 kb的非编码序列作为目的启动子，通过测序结果区分At、Dt类型。本研究克隆出1701 kb GhFT1-A启动子和1771 kb GhFT1-D启动子（简称1.8 kb）。序列比对分析发现了At和Dt基因组上不同GhFT1启动子间存在许多核苷酸序列差异。GhFT1-A和GhFT1-D启动子上存在大量的、作用广泛的顺式作用元件，并发现了一个顺式作用元件富集的重复片段区域。启动子活性检测证明了GhFT1基因上游1.8 kb的At和Dt启动子均具有活性，但At亚基因组启动子的活性弱于Dt型。陆地棉编码成花素同源基因GhFT1的启动子对于调控GhFT1-A和GhFT1-D的表达具有重要作用，并且它们之间的活性存在差异，暗示At和Dt基因组对开花调控作用不同。

陆地棉；FLOWERING LOCUS T 1；成花素；启动子；顺式作用元件

开花是显花植物由营养生长向生殖生长转变的重要遗传性状，其由外部环境影响、内部基因调控以及自身的生长阶段共同决定。目前，在拟南芥中已发现6条主要的开花调控途径，包括光周期途径、春化途径、赤霉素途径、自主途径、年龄依赖途径和温敏途径［1］。其中，位于开花调控网络中心的FLOWERING LOCUS T(FT)基因，整合了多个开花调控途径的信号，在叶片维管束中编码成花素(Florigen)蛋白后，再运输到茎顶端分生组织，作用于其下游的花身份基因，促进植物开花［2］。异源四倍体陆地棉(Gossypium hirsutumL.)是世界上最重要的纤维作物。我国是世界上最大的纺织品生产国和消费国，因此棉花产业在国民经济中具有十分重要的地位。新疆作为国内规模最大的棉花种植省区，地处我国西北边陲，物候环境较为特殊。研究棉花开花的分子调控机制，通过缩短棉花的营养生长周期，培育新疆地区的棉花早熟品种，能够有效的避免秋季气温突然下降对棉花产量带来的影响。虽然 Guo 等［3］和 Li等［4］在陆地棉中克隆了FT的直系同源基因Gossypium hirsutumFLOWERING LOCUS T 1(GhFT1)，并证明该基因能够促进植物的早花，但是对该基因启动子的研究知之甚少。

启动子是位于基因5’端上游的一段非编码核苷酸序列，能够激活RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性，而且通过转录因子与启动子上顺式作用元件的相互作用，可以调控基因的表达，因此对启动子的研究有助于理解基因的表达调控机制。目前在拟南芥中，对于FT启动子的研究较为深入，已经验证了光周期途径中重要的转录因子CONSTANS(CO)能够与FT启动子近端的顺式作用元件相互作用，从而促进FT的转录［5］。 Nuclear Factor Y(NF-Y)转 录 因 子 能 够 与 FT启动子远端的CCAAT-box和CO蛋白相互作用并稳定 CO与FT启动子的结合，据此 Cao等［6］提出了光周期依赖的开花招募模型。近年来，许多开花植物如水稻［7］、小麦、大麦［8］、大豆［9］、葡萄［10］、苹果［11］和桑树［12］等FT基因的启动子相继得到克隆，并验证了其FT启动子的活性。

2015年，陆地棉(TM-1)全基因组测序结果释放，并提出：选择和驯化的基因组标签在A亚基因组与纤维发育的正向基因选择相关，在D亚基因组与耐逆的正向选择基因有关［13］。这说明来自 At、Dt供体的GhFT1基因可能存在活性差异。并且陆地棉全基因组测序结果为GhFT1启动子的克隆和研究提供了良好的条件。本研究克隆了1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D基因的启动子，并对启动子的序列特征与活性进行了进一步的分析，以期为阐明GhFT1的表达调控规律和早熟棉花的分子育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

陆地棉品种新陆早42和哥伦比亚生态型(Col-0)拟南芥(Arabidopsis thaliana)由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 棉花基因组DNA的提取

选取陆地棉品种新陆早42成熟叶片为材料，液氮速冻后采用改良CTAB法［14］进行基因组DNA的提取。

1.2.2 GhFT1-A和GhFT1-D启动子序列的查找及比对分析

将本实验室前期获得的GhFT1基因序列(Ge n-Bank登录号：HM631972)，在陆地棉全基因组基因注释结果中序列比对，发现本实验室前期获得的GhFT1来自Dt亚基因组，在本研究中简称为GhFT1-D，并获得了来自At亚基因组的、与GhFT1-D同源的GhFT1-A基因。

通过 DNAMAN (http://www.lynnon.com/)、Clustal W 2.1(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)和GeneDoc(www.nrbsc.org/)等软件序列比对分析GhFT1-A和GhFT1-D。

1.2.3 GhFT1-A和GhFT1-D启动子的克隆

将GhFT1-A和GhFT1-D在陆地棉全基因组数据库中分别序列比对到At和Dt亚基因组上，截取GhFT1-A和GhFT1-D序列上游的1段1.8 kb的非编码核苷酸作为目的启动子序列［15］。根据目的启动子序列设计特异引物 (表1)，以陆地棉基因组DNA为模板进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳分离，将大小正确的启动子DNA片段以快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN)回收并分别克隆到中间载体pMD18-T(TaKaRa)上，通过华大基因公司的测序结果区分出1701 kb GhFT1-A启动子和1771 kb GhFT1-D启动子（简称为1.8 kb）。

表1 使用的引物名称及序列Tab.1 Primers used in this study

1.2.4 GhFT1-A和GhFT1-D启动子序列的生物信息学分析

用PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant-care/html/)和PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)数据库对1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子上的顺式作用元件进行在线预测。用DNAMAN(http://www.lynnon.com/)、mVISTA(http://genome.lbl.gov/vista)软件对启动子进行序列比对分析。用Nucleic Acid Dot Plots(http://lectures.molgen.mpg.de/Pairwise/DotPlots/)软件对启动子进行重复序列的查找。

1.2.5 植物表达载体的构建及拟南芥的遗传转化

Pst I和Nco I(TaKaRa)双酶切pCAMBIA1301载体、pMD18-T-GhFT1pro载体，并回收pCAMBIA1301载体大片段和1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子片段。将1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子回收产物与pCAMBIA1301载体大片段连接，得到GhFT1pro:GUS终载体，并将连接产物转化至50 μL DH5α感受态细胞。挑取单克隆，碱裂解法小量提取大肠杆菌质粒，并用Pst I和Nco I双酶切鉴定。用冻融法将鉴定正确的质粒转化至农杆菌GV3101感受态，菌液PCR鉴定农杆菌GV3101转化子。

拟南芥Col-0种子经70%酒精消毒2 min，无菌水洗2次；再加入2%NaClO消毒7 min，无菌水洗5次，4℃春化3-4 d后，均匀地将种子播撒在1/2的MS培养基上。在25℃，16 h光照、8 h黑暗的光照培养箱中培养，于2-3片真叶期移栽到含有蛭石和营养土(体积比为1∶1)的盆钵中，之后置于相同环境条件下的人工气候室里培养。拟南芥盛花期时采用花滴法［16］进行遗传转化。

1.2.6 GUS染色及其基因表达分析

分别以1.8 kb GhFT1pro:GUS纯合转基因拟南芥作为阳性对照，野生型拟南芥(Col-0)作为阴性对照，取开花当天的成熟叶片浸入0.5 mg/L X-Gluc(Sigma)溶液中，37℃避光过夜后用无水乙醇脱色除去叶绿素，观察是否有蓝色出现，用解剖显微镜拍照保存，独立重复实验 3 次［17］。

采用植物总RNA提取试剂盒，参照其说明书(TIANGEN)，提取拟南芥成熟叶片的总RNA，利用北京百泰克公司的Supermo III M-MLV反转录酶，参照试剂盒说明书，合成cDNA第1链。根据GUS基因的序列，设计实时荧光定量PCR的引物(表1)，内参基因为拟南芥Actin 2基因 (GenBank登录号：NM_180280)。以拟南芥开花当天的成熟叶片cDNA为模板，采用北京康为世纪有限公司FASTSYBR Mix-ture(With ROX)试剂盒，利用7500 Fast实时荧光定量 PCR 仪(Life Technologies，FosterCity，CA，USA)检测GUS基因表达量。检测每份样品目的基因和内参基因的CT值 (循环阈值)，每份样品3次重复，并且进行3次独立的实验。采用2–ΔCT法对实验所得数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 陆地棉GhFT1-A和GhFT1-D序列比对分析

将在陆地棉全基因组基因注释结果中，通过GhFT1序列比对获得的GhFT1-A和GhFT1-D，进行序列比对分析，发现GhFT1-A和GhFT1-D的编码区序列 (Coding sequence，CDS)相似性高达 98.1%。GhFT1-A和GhFT1-D的氨基酸序比对，只有1个氨基酸 Asn(N)和 Ser(S)的差异(图 1)，并且该差异的单个氨基酸并不位于FT-like蛋白的保守基序和保守位点上。这说明GhFT1-A和GhFT1-D之间可能并不存在活性或功能上的差异。

图1 GhFT1-A和GhFT1-D氨基酸序列比对Fig.1 Amino acid sequences alignment of GhFT1-A and GhFT1-D

2.2 陆地棉1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子顺式作用元件的分析

将测序正确的1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子通过PlantCare和PLACE在线分析其顺式调控元件，如表 2、表 3所示，GhFT1-A和 GhFT1-D启动子上不仅存在着真核生物启动子必需的核心元件(TATA-box、CAAT-box)，还存在着大量的光响应顺式作 用 元 件 (G-box、Pc-CMA2c、Box1、as-2-box、Box 4、ACE、AT1-motif、GT1-motif、Sp1、TCT-motif、ATCT-motif、GC-motif)。激素响应顺式作用元件，如赤霉素响应元件 (TATC-box、P-box)、脱落酸响应元件(ABRE)、水杨酸响应元件(TCA-element)和生长素响应元件(AuxRR-core)；抗逆响应顺式作用元件，如热激响应元件(HSE)、干旱诱导下的MYB结合元件(MBS)、胁迫响应元件 (TC-rich repeats)和厌氧诱导响应元件(ARE)；组织特异性表达顺式作用元件，如芽特异表达元件(as-2-box)、分生组织表达相关元件(CAT-box)；及节律调控响应顺式作用元件(circadian)也分别的分布在GhFT1-A和GhFT1-D启动子上。GhFT1-A和GhFT1-D启动子上具有众多的顺式作用元件及其广泛的作用，这一结果与FT基因整合各种开花调控信号、位于开花调控网络的中心的功能相符合。

表2 1.8 kb GhFT1-A启动子上顺式作用元件的预测Tab.2 Predication of cis-elements in the 1.8 kb GhFT1-A promoter

表3 1.8 kb GhFT1-D启动子上顺式作用元件的预测Tab.3 Predication of cis-elements in the 1.8 kb GhFT1-D promoter

2.3 陆地棉1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子序列特性分析

DNAMAN序列比对1.8kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子之间的相似性为90.84%，高度的保守性有可能造成GhFT1-A和GhFT1-D启动子功能的冗余。然而通过mVIST在线序列比对分析 (图2)发现，GhFT1-A启动子相对于GhFT1-D启动子，存在4个缺失片段，这造成了GhFT1-A和GhFT1-D启动子之间的主要差异。结合顺式作用元件分析结果发现，由于单核苷酸多态性(SNPs)及缺失片段的存在造成了1.8 kb GhFT1-A启动子上的光响应顺式作用元件元件数量少于GhFT1-D启动子。这说明GhFT1-A和GhFT1-D启动子的活性之间可能存在差异。

图2 1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子序列比对Fig.2 Sequences alignment between 1.8 kb GhFT1-A and GhFT1-D promoters

用Nucleic Acid Dot Plots分析1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子内的重复序列发现，GhFT1-A和GhFT1-D启动子上，1100-1400 bp存在着大量的重复片段，这一区域也是顺式作用元件富集的区域(图3)，这说明了该区域可能对GhFT1-A和GhFT1-D启动子的活性起着重要的作用。

图3 1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子上的重复序列Fig.3 Repeated sequences in 1.8 kb GhFT1-A and GhFT1-D promoters

2.4 陆地棉1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子的活性分析

1.8 kb GhFT1pro:GUS的植物表达载体构建如图4A所示。

利用农杆菌GV3101将终载体以花滴法［16］转化Col-0拟南芥，筛选T3纯合的转基因拟南芥作为后续实验的材料。

取开花当天拟南芥成熟叶片，进行GUS组织化学染色发现，野生型拟南芥叶片并未出现蓝色 (图4B)，而1.8 kb GhFT1pro:GUS转基因拟南芥植株的叶片均呈现较强的蓝色，而且GhFT1-Dpro:GUS的染色程度要深于GhFT1-Apro:GUS的。图4C中的GUS基因在拟南芥叶片中表达量的结果与图4B中的染色结果基本一致，这说明了1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子均具有活性，且GhFT1-A启动子的活性要弱于GhFT1-D启动子。

图4 1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子上的活性检测Fig.4 Activity analysis of 1.8 kb GhFT1-A and GhFT1-D promoters

3 讨论

前人的研究已经证明了FT同源基因在不同的植物中均体现出保守的调控开花的功能，然而对于FT基因启动子的研究仅在模式植物拟南芥中较为明确。水稻中，7种不同栽培种的水稻FT同源基因Heading Date 3a(Hd3a)的启动子根据SNPs分为A、B两种类型，并且发现不同类型的Hd3a启动子对应着不同的Hd3a表达量。然而在A、B不同类型的Hd3a启动子上，目前已知的顺式作用元件并无明显的差异，所以不同类型的Hd3a启动子与其对应的Hd3a的表达量差异可能是由某些未知的核苷酸序列造成［18］。在小麦中发现，显性 VERNALIZATION 3(Vrn 3)等位基因与在Triticum aestivumFT(TaFT)启动子中插入的反转录元件密切相关［8］。大豆FT同源基因Glycine maxFT2a(GmFT2a)的启动子在80个品种中存在17种单倍型，存在丰富的SNPs，并且在强选择压力下，富集于HT06这种单倍型。通过进一步深入的关联分析发现，GmFT2a启动子的SNPs可能与开花时间及对光周期的响应有关［19］。

陆地棉中克隆的FT同源基因GhFT1，具有促进植物早花的功能［3-4］，然而目前对陆地棉GhFT1启动子的研究甚少。陆地棉全基因组测序结果强调了At与Dt亚基因组内同源基因可能存在着功能上的差异［13］，所以我们通过陆地棉全基因组基因注释，查找了来自不同At、Dt亚基因组的GhFT1-A和GhFT1-D，发现它们在氨基酸序列上并不存在可能引起功能分化的差异。本研究克隆了GhFT1-A和GhFT1-D基因上游1.8 kb的启动子序列。顺式作用元件分析预测发现了1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子上存在着大量且作用广泛的顺式作用元件，这反映了GhFT1基因受到严格的调控，从而控制陆地棉合适的开花时间。序列比对分析1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子发现，虽然2种类型启动子的相似性高达90.84%，但GhFT1-A启动子较GhFT1-D启动子存在着4个缺失片段，SNPs及缺失片段造成了GhFT1-A启动子上的光响应顺式作用元件少于GhFT1-D的，这一结果暗示了GhFT1-A和GhFT1-D启动子的活性可能存在差异。通过GUS组织化学染色及荧光定量检测1.8 kb GhFT1pro:GUS转基因拟南芥中，由GUS活性、GUS基因表达量代表的启动子活性进一步验证了1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子均具有活性且GhFT1-A启动子的活性要弱于GhFT1-D启动子。通过重复序列分析还在GhFT1-A和GhFT1-D启动子-1100--1400 bp上均发现了1个顺式作用元件富集的，这可能对启动子活性具有重要作用的重复片段富集区。

本研究对1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子的克隆及分析，可为GhFT1-A和GhFT1-D表达调控规律的探索奠定了理论基础，然而在GhFT1-A和GhFT1-D启动子上未发现典型的TGTG(N2-3)ATG的CO结合位点。陆地棉中是否存在植物中保守的FT/CO调控模型，还有待进一步的研究。

4 结论

（1）本研究从陆地棉基因组中成功克隆了1.8 kb GhFT1-A和 GhFT1-D启动子；（2）1.8 kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子上存在着大量且作用广泛的顺式作用元件，并且在-1100--1400bp的重复片段富集区域上顺式作用元件也相对富集，这说明了GhFT1-A和GhFT1-D的启动子对于调控GhFT1-A和GhFT1-D基因的表达具有重要作用；（3）1.8kb GhFT1-A和GhFT1-D启动子均具有活性且GhFT1-A启动子的活性弱于GhFT1-D启动子。

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Cloning and activity analysis of the promoters of FT1 homoeologs,GhFT1-A and GhFT1-D encoding the florigen from Gossypium hirsutumL.

Cai Darun,Li Chao,Huang Xianzhong*
(Special Plant Genomics Laboratory/College of Life Sciences,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China)

The upstream sequences of GhFT1-A and GhFT1-D were obtained by BLAST againstupland cotton genome using GhFT1 gene as query,and their genomic sequences were cloned by PCR using specific primers.In this study,we obtained the genomic sequences of promoters of GhFT1-A and GhFT1-D homoeologs fromGossypium hirsutumL.cv.XLZ 42 which were 1,701 bp and 1,771 bp lengths,respectively.In both promoters,we had predicted lots of cis-acting elements which function in a wide range.Moreover,there was a region containing a number of repeated sequences and abundant cis-acting elements in GhFT1-A or GhFT1-D promoter respectively.Sequences alignment showed that a lot of nucleotide differences exist between these two promoters.Promoters activity analyses showed that both promoters he different activities,and the activity of 1,701 bp GhFT1-A promoter was weaker than 1,771 bp GhFT1-D promoter.1.8 kb length genomic sequences of the upstream of GhFT1-A and GhFT1-D play important roles in regulating the expression of GhFT1 genes,whereas At and Dt subgenome promoters have differential activities,suggesting their different effects on flowering regulation.

Gossypium hirsutumL.;FLOWERING LOCUS T1;florigen;promoter;cis-acting element

S562

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.03.007

1007-7383(2017)03-0305-07

2017-03-29

国家自然科学基金项目(31360366)，新疆兵团中青年科技创新领军人才项目（2016BC001）

蔡大润(1990-)，男，硕士研究生，研究方向为植物分子遗传学，e-mail:cdrhxz104@163.com。

*通信作者：黄先忠(1974-)，男，教授，从事植物响应逆境生理生态适应的分子机制、植物开花信号转导的分子调控机制方面的研究，e-mail:xianzhongh106@163.com。