福建柏叶片全蛋白3种提取方法的比较

吴玉香 沈少炎 郑郁善

摘要 [目的]探索适于福建柏蛋白质组学研究的全蛋白样品制备的最优方案。 [方法]以福建柏叶片为材料，利用3种全蛋白提取方法：TCA/丙酮法、酚提法和TCA/酚提结合法，研究不同提取方法对福建柏蛋白双向电泳结果的影响。[结果]TCA/丙酮法制备的蛋白点数较少，为285个，蛋白质在制备过程中流失较多；酚提法得到的蛋白点最多，为1 226个，蛋白点较清晰但pH中端部分有轻微的蛋白堆积；TCA/酚提结合法得到了813个蛋白点，蛋白点较清晰，无明显的蛋白堆积现象。[结论]在福建柏蛋白质组学研究中，酚提法更适于福建柏全蛋白的制备，且酚提法明显优于TCA/酚提结合法。

关键词 福建柏；全蛋白；蛋白提取；双向电泳

中图分类号 S312 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）01-0135-04

Comparison of the Three Extraction Methods of Fokienia hodginsii Leaves Total Protein

WU Yuxiang1， SHEN Shaoyan1， ZHENG Yushan1，2*

（1.College of Landscape，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002；2.College of Forestry，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002）

Abstract [Objective] To study the most efficient method for sample preparation of Fokienia hodginsii proteomics. [Method] Three different methods including TCA/acetone，phenol extraction method and TCA/phenol extraction method were analyzed by separation effect of 2DE with Fokienia hodginsii leaves as material. [Result]The results showed that using TCA/acetone method，285 protein spots could be detected on 2DE gels which had severest loss in proteins. The phenol extraction method was the best with more clear protein spots as many as 1 226 protein spots on 2DE gels，but using protocol extraction method，there were slightly protein accumulation phenomena at neutral. TCA/phenol extraction method was produced 813 protein spots on 2DE gels with more clear protein spots and slight protein accumulation phenomena. [Conclusion]The phenol extraction method is efficient and optimal method for preparation of Fokienia hodginsii total protein， meanwhile the phenol extraction method is better than TCA/phenol extraction method.

Key words Fokienia hodginsii；Total protein；Protein extraction；2DE

在后基因組时代，蛋白质组学快速发展并成为研究基因表达及其功能的重要途径[1]。随着液相层析法技术的发展，双向电泳（2-DE）在蛋白质组学中的应用逐渐减少[2]，但双向电泳技术仍是获得重复性好、可见性良好以及可信度高蛋白质的有效分离手段，尤其是在高复杂性蛋白质混合物的分离中应用广泛[3]。在蛋白质组学研究中样品的提取和准备是极其重要的第一步，在一些复杂生物样本（如一些复杂的细菌原蛋白）的提取中，如果未采取适当的方法来获得高质量的蛋白样本，很难获得该样本高分辨率的双向电泳图像[4]。理想的蛋白提取方法应能够将所有的蛋白质均匀溶解，同时将对蛋白质分离过程产生影响的其他化合物质（核酸类、脂类、多糖多酚）消除。目前，无一种通用的方法能够制备出完美的蛋白质样品，每一种植物样本都需要一种相对理想的提取方法[5]。

经过研究者长期的探索，发现了多种植物蛋白质提取的方法，为植物蛋白质组学研究提供了试验基础[4，6-7]。目前植物全蛋白的提取主要有3种方法：TCA/丙酮法、酚提法以及TCA/酚提结合法。

TCA/丙酮法是蛋白质提取方法中相对简单的一种。这种植物全蛋白的提取方法已成功应用于多种植物组织中[8-9]，包括玉米[10-11]和木本植物[12]。但该方法对一些成熟的果实、橄榄叶等，无法制备出较好的蛋白样品。此外，该方法无法完全溶解组织样品中的蛋白质[13]。

酚提法的研究可追溯于20世纪50年代，已成功应用于多种植物组织蛋白提取中[14-15]，尤其是植物果实中[16]。酚提法较TCA/丙酮法在去除蛋白质干扰混合物有更好的效果[4]。但由于酚提法的提取液中缺少去污剂（如SDS），造成该方法提取的某些蛋白质数量较少，达不到双向电泳分析的数量级。此外，对于像棉花纤维、植物根系以及橄榄叶，酚提法也无法很好地去除干扰混合物[17-18]。

TCA/酚提结合法是将上述2种方法结合，能够较为有效地提取植物全蛋白[19]。TCA/酚提结合法也在植物蛋白提取试验中得到验证，研究者通过该方法提取了竹类叶片、橄榄老叶以及红树叶片的蛋白质[19]。但TCA/酚提结合法操作步骤过于繁琐，较费时，会造成部分蛋白的流失。

福建柏[Fokienia hodginsii（Dunn）Henry et Thomas]为福建乡土树种，俗称建柏，是裸子植物门柏科纲福建柏属的单一种植物，与银杏、鹅掌楸等同为孑遗树种，同时又是我国珍贵野生濒危物种，被列为国家二级保护树种[20]。福建柏在福建以外的地域生长十分缓慢，且幼苗期生长容易遭受病虫害，危及福建柏的成材率与使用价值。不同蛋白质的相互作用对于植物病虫害的防御具有重要意义[21]。双向电泳技术与质谱技术的结合，是目前蛋白质组学研究的重要方向。研究者已发现了多种植物蛋白的提取方法，但对于福建柏植物蛋白提取及其蛋白组学研究少见报道。为了探索适合福建柏全蛋白提取的方法，使福建柏蛋白质双向电泳的图谱分辨率更加清晰，笔者对3种提取方法进行了比较，研究双向电泳中凝胶图谱上的差异，筛选出适合福建柏植物蛋白的提取方法及双向电泳体系。

1 材料与方法

1.1 材料

福建柏由福建农林大学工业原料林研究所提供。福建柏组织采用顶部的嫩芽叶，剪取后立即用液态N2速冻存储在-80 ℃冰箱中。

1.2 试剂及仪器

硫脲、碘乙酰胺（IAA）、二硫苏糖醇（DTT）、载体两性电解质、17 cm pH 3～10预制IPG干胶条（BIO-RAD，USA）、矿物油；过硫酸铵（AP）、低熔点琼脂糖、尿素（urea）、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）、Tris-base碱；十二烷基硫酸钠（SDS）、牛血清白蛋白（BSA）、标准蛋白Marker、考马斯亮蓝R-250（CBB R-250）、交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、饱和酚；乙酸、乙醇、甲醇、甲醛、碳酸钠、硝酸银、硫代硫酸钠、三氯乙酸（TCA）、甘油。

Eppendorf Premium U570超低温冰箱、美国伯乐PROTEAN i12TMIEF System等电聚焦仪和PROTEAN II xi cell电泳仪、LABO GENE SCAN SPEED离心机、Thermo MULTISKAN MK3酶标测定仪、UMAX Power Look 2100XL凝胶扫描仪。

1.3 蛋白样品的制备

1.3.1 TCA/丙酮法。参照Isaacson等[9]的方法。取0.2 g福建柏叶片去掉木质化枝用液氮研磨，加入1.5 mL TCA/丙酮溶液（含质量分数10% TCA和体积分数007%β-巯基乙醇），置于-20 ℃沉淀过夜，于4 ℃、12 500 r/min离心15 min，弃上清，沉淀用4倍体积80% 丙酮（含体积分数007%β-巯基乙醇）清洗，于-20 ℃静置15 min后于4 ℃、12 500 r/min离心15 min，弃上清，重复上述步骤4次，最后沉淀即为全蛋白。得到的沉淀用真空干燥器干燥后加入蛋白裂解液水解，裂解后保存于-80 ℃冰箱中，用Bradford法测定蛋白质的含量[22]，并进行双向电泳。

1.3.2

酚提法。参照Wu 等[13]的方法。取0.2 g福建柏叶片去掉木质化枝用液氮研磨，加入0.8 mL蛋白提取液（0.9 mol/L蔗糖、体积分数5% β-巯基乙醇、0.07 mol/L SDS、体积分数7%的1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8）及相同体积Tris-饱和酚，于恒温摇床4 ℃振荡30 min后于4 ℃、12 500 r/min离心15 min；小心吸取上层酚相，再加入酚相等体积的提取液；于恒温摇床4 ℃振荡30 min后于4 ℃、12 500 r/min离心15 min，重复此步骤2次；最后向酚相中加入5倍体积0.1 mol/L的甲醇醋酸铵溶液（0.1 mol/L醋酸铵溶于甲醇溶液），置于-20 ℃沉淀过夜；于4 ℃、12 500 r/min离心15 min；弃上清，加入4倍体积的预冷甲醇清洗沉淀，涡旋混匀后于4 ℃、12 500 r/min离心10 min。小心吸取上清液并丢弃，重复甲醇清洗步骤3次；最后用丙酮代替甲醇重复清洗步骤2次，所得沉淀用真空干燥器干燥后加入蛋白裂解液水解，裂解后保存于-80 ℃冰箱中，用Bradford法测定蛋白质含量[22]，并进行双向电泳。

1.3.3

TCA/酚提結合法。参照TCA/丙酮与Tris-饱和酚结合法法并略有修改[18]。操作流程见图1。操作步骤：取福建柏叶片0.2 g，剪取嫩叶嫩枝，加入适量PVPP后液氮研磨成粉；福建柏粉末转入2 mL离心管中并加满10%TCA丙酮提取液（含体积分数0.07%β-巯基乙醇和质量分数10% TCA），涡旋混匀后于4 ℃、12 500 r/min离心6 min，弃上清；在离心管中加满0.1 mol/L甲醇醋酸铵溶液（0.1 mol/L醋酸铵溶于甲醇溶液），涡旋混匀后4 ℃、12 500 r/min离心，弃上清；所得沉淀用80%丙酮清洗，涡旋混匀后4 ℃、12 500 r/min离心并丢弃上清液；置于通风橱中自然风干弃除残存的丙酮；在沉淀中加入0.8 mL Tris-饱和酚及0.8 mL SDS蛋白提取液（0.9 mol/L蔗糖、体积分数5%β-巯基乙醇、0.07 mol/L SDS、体积分数7%的1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8），涡旋振荡混匀后室温静置10 min，于4 ℃、12 500 r/min离心；将上层酚相转移至新的离心管；在离心管中加入5倍体积0.1 mol/L甲醇醋酸铵溶液，于-20 ℃中静置沉淀2 h以上，于4 ℃、12 500 r/min离心6 min，弃上清；所得沉淀用预冷甲醇和80%丙酮分别清洗1次，每次清洗均涡旋混匀并于4 ℃、12 500 r/min离心，所得沉淀用预冷甲醇和80%丙酮分别清洗1次，并按相同参数离心，最后沉淀即为福建柏叶片全蛋白；沉淀用真空干燥器干燥后加入蛋白裂解液水解，裂解后保存于-80 ℃冰箱中，用Bradford法测定蛋白质含量[22]，并进行双向电泳。

1.4 全蛋白样品SDS-PAGE电泳

垂直电泳仪采用美国伯乐公司的PROTEAN II xi cell电泳仪，分析不同方法提取的福建柏叶片全蛋白条带的分布差异，丙烯酰胺凝胶为7 cm×7 cm，梳孔厚1 mm，12%分离胶，6%浓缩胶。制备4块丙烯酰胺凝胶用来重复对比。取超低温冰箱中储存的全蛋白溶液加入等体积上样缓冲液（含体积分数20%0.5 mol/L Tris-HCl pH 6.8，体积分数40%的10%SDS，体积分数20%甘油，体积分数5%的1%溴酚蓝，0.1 mol/L DTT），涡旋混匀后沸水浴4 min，结束后室温冷却加样；蛋白样品上样体积10 μL，标准Marker上样10 μL，电泳参数设置10 mA/胶。凝胶电泳结束后采用考马斯亮蓝R-250进行染色[23]。脱色后用UMAX Power Look 2100XL凝胶扫描仪进行扫描。

1.5 双向电泳

参照BIO-RAD公司2-DE实验指南手册进行，采用美国伯乐公司17 cm（pH 3～10）IPG胶条，上样量与上样体积分别为80 μg和300 μL。设置2个重复，取6根IPG胶条进行被动水化：样品线性加入水化盘中，不要产生任何气泡，将胶条胶面朝下置于样品上，使胶条与样品充分接触，再在胶面上覆盖矿物油，置于水平桌面上进行水化，水化时间24 h。等电聚焦（IEF）使用美国伯乐公司PROTEAN i12TMIEF System等电聚焦仪，等电聚焦参数：250 V（30 min）线性，1 000 V（1 h）快速，10 000 V（5 h）升压，10 000 V（伏时数60 000 Vh），500 V保持。

IPG胶条在等电聚焦完成后，一个重复组置于-20 ℃冻存，另一组即刻进行胶条平衡。第1次平衡液（6 mol/L尿素，质量分数2%十二烷基硫酸钠SDS，体积分数20%甘油，0.05 mol/L的Tris-HCl pH 8.8，质量分数2%DTT），第2次平衡液（6 mol/L尿素，质量分数2%十二烷基硫酸钠SDS，体积分数20%甘油，0.05 mol/L Tris-HCl pH 8.8，质量分数25%碘乙酰胺），每次平衡均需摇床振荡不超过15 min，并吸干平衡液。2次平衡完成后进行垂直电泳，胶浓度为12%，起始用低电流5 mA/胶，待样品完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流25 mA/胶，待指示剂到达凝胶底部结束电泳。采用改良的银染法[24]对凝胶进行染色。

显色后的凝胶用凝胶扫描仪扫描图像，分辨率设为1 000 dpi，保存格式为TIF；用PDQUEST 8.0.1 software凝胶图像软件对图像进行分析。

2 结果与分析

2.1 3种蛋白提取方法凝胶电泳结果

将3个福建柏全蛋白进行SDS-PAGE垂直凝胶电泳分析，结果显示（图2），3种提取方法（A、B、C）间的蛋白条带有明显差异，表明不同提取方法对福建柏全蛋白制备的结果不同；酚提法的蛋白条带颜色明显

区别于其他2种方法的条带，表明在上样量相同的情况下，酚提法蛋白质缺失最少，且在26 ku和60 ku附近有2条明显的高丰度蛋白条带；而TCA/丙酮法和TCA/酚提 结合法较酚提法的蛋白条带明显偏少，且无集中的高丰度蛋

白带，其中，TCA/丙酮法的条带最少，颜色最浅，无明显的

高丰度蛋白。总体表现为酚提法>TCA/酚提结合法>TCA/丙酮法。

对3种方法制备的福建柏全蛋白进行2-DE双向电泳分析，凝胶扫描结果见图3，用软件分析后得到的蛋白点数明显不同。TCA/丙酮法获得285个蛋白点，蛋白质无堆积现象，主要集中在中性端，酸性端与碱性端的蛋白质损失严重（图3A）；

酚提法得到1 226个蛋白点，较其他2种方法分离的蛋白点更多，但在中性端的蛋白点有轻微的堆积现象和竖向条纹（图3B）；

TCA/酚提结合法得到813个蛋白点，分离效果较好，得到的蛋白点较清晰且规则，且无明显的蛋白点堆积，但存在轻微的拖尾现象（图3C）。因此，与TCA/丙酮法相比，酚提取及TCA/酚提结合法更适合福建柏全蛋白的提取。

2.2 3种提取方法的比较

由表1可知，在3种提取方法中，酚提法作为适中的提取方法，操作步骤较结合法更为简洁，不会造成大量蛋白质流失；且酚提法较TCA/丙酮法更容易获得较多的溶解蛋白质。

3 结论与讨论

植物蛋白質提取方法较多，不同植物、不同植物器官以及组织的化学成分不同，所以针对特定植物的最佳蛋白质提取方法也有区别，根据试验材料以及试验设备的差异，需要采用不同的制备方法[2，6，16]。该研究通过对福建柏3种蛋白提取方法得到的2-DE双向电泳图谱进行分 析，以期筛选出适合福建柏叶片全蛋白的提取方法。根据福建柏蛋白提取结果可以看出，与TCA/丙酮法相比，酚提法和TCA/酚提结合法能够获得较好的双向电泳结果，获得的蛋白点多、清晰，且杂质更少，重复性更高，便于后续的质谱分析。

从双向电泳凝胶可以看出，TCA/丙酮法得到的蛋白点明显少于酚提法和TCA/酚提结合法，可能是由于较多未知蛋白质无法溶解及盐离子的影响，使较多的蛋白质流失及等电聚焦IEF的效果不理想。

酚提取法有相对较高的净化力，能够减少蛋白质分子之间的相互作用。该试验采用2种酚提方法，这2种方法都提高了蛋白质的收集程度，尽可能减少福建柏蛋白质的流失，在凝胶结果中明显优于TCA/丙酮法；同时，在2种酚提法的酚相中，蛋白质通过甲醇醋酸铵溶液过夜沉淀后，多次重复利用丙酮及甲醇清洗沉淀，可以去除色素以及铵离子等TCA/丙酮法无法去除的杂质。酚提法采用pH 8.8的Tris-HCl，较高的pH能够抑制蛋白酶的分解作用，且能够电离酚类化合物，从而减少H+和蛋白质的结合，加速蛋白质的溶解。通过对凝胶分离效果的比较，传统的酚提法蛋白点数多于TCA/酚提结合法、TCA/丙酮法，可能是由于结合法的操作步骤繁琐，操过过程中造成部分蛋白质流失。而在中性端有轻微的蛋白质堆积，可能是在等电聚焦除盐过程中盐离子的影响造成的。针对福建柏蛋白组学研究，福建柏全蛋白提取的最优方法为酚提取方法。

由于裸子植物的葉片质地较硬，研磨过程会消耗较长时间，如果未保持低温可能造成蛋白的降解和流失。在磨样过程中加入适量的PVPP，可以除去大量的色素、酚类等物质，并通过多次的丙酮、甲醇清洗去除一些盐离子的影响。

该试验提供了3种福建柏全蛋白的制备方法，对这3种方法提取的全蛋白进行SDS-PAGE电泳条带分析和2-DE，并对蛋白质分离情况进行对比。结果发现，传统的酚提法得到的福建柏蛋白点最多，分离效果较好，其次是TCA/酚提结合法，最后是TCA/丙酮法。因此，该研究认为酚提法较为适宜福建柏全蛋白的制备，且明显优于TCA/酚提结合法。

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