蒙药漏芦花总黄酮提取和纯化工艺研究

2017-07-10李红杨晓歌李霄

安徽农业科学 2017年1期

李红　杨晓歌　李霄

摘要 [目的] 优化漏芦花总黄酮提取工艺和纯化工艺，为漏芦花抗炎药效部位的开发奠定基础。 [方法] 以总黄酮为指标，采用UV测定方法，在检测波长413 nm下，测定总黄酮含量，确定纯化漏芦花总黄酮纯化大孔树脂型号；并采用正交试验分别考察乙醇浓度、回流次数、回流时间和乙醇用量对漏芦花总黄酮提取工艺的影响及乙醇体积分数、上样液质量浓度、pH和上样液流速对总黄酮纯化工艺的影响。 [结果] 确定漏芦花总黄酮提取工艺的最优方案为采用75%乙醇溶液，回流2次，每次回流时间45 min，乙醇用量12倍，影响因素的顺序从大到小依次为乙醇浓度、回流时间、乙醇用量、回流次数。纯化工艺试验中，最优纯化工艺条件为上样液浓度0.05 g/mL，上样液pH为5，上样液流速为3 mL/min，径高比为1 ∶9，最佳上样量为药材量与树脂用量比2 ∶1，乙醇体积分数50%，洗脱液用量5 BV；纯化后干膏里漏芦花抗炎有效部位总黄酮含量为42.3%。 [结论] AB- 8型大孔树脂可有效富集、纯化漏芦花总黄酮，优选的提取和纯化工艺稳定可行。

关键词漏芦花；提取；纯化；大孔树脂；总黄酮

中图分类号 S567；R284.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）01-0124-04

Extraction and Purification Process of Total Flavonoids from Rhaponticum uniflorum （L.）DC.

LI Hong， YANG Xiaoge， LI Xiao*

（Beijing University of Technology， Beijing 100124）

Abstract [Objective] To optimize extraction and purification process of total flavonoids from Rhaponticum uniflorum， to lay a foundation for development of antiinflammatory parts of Rhaponticum uniflorum. [Method] UV was employed to determine the content of total flavonoids with detection wavelength at 413 nm；using orthogonal design to investigate effects of ethanol concentration， reflux times， reflux time and alcohol dosage on extraction of total flavonoids from Rhaponticum uniflorum， as well as effects of ethanol volume fraction， mass concentration of sample solution， pH and sample liquid flow rate on purification of total flavonoids. [Result] As for extraction process， the optimum scheme was： 12 times extraction solvent dosage， 75% ethanol reflux， extraction for 2 times， each time for 45 minutes. The order of influencing factors was ethanol concentration， reflux time， ethanol dosage and reflux times. As for purification process， optimum technological conditions were as follows： ratio of diameterheight 1 ∶9， sample solution concentration of 0.05 g/mL， sample solution flow rate of 3 mL/min， pH 5.0， with 5 BV of 75% ethanol as eluent；total flavonoids was 42.3% in antiinflammatory parts of Rhaponticum uniflorum after purification. [Conclusion] Total flavonoids from Rhaponticums dried flowers could be effectively purified and enriched by AB8 macroporous resin.

Key words Rhaponticum uniflorum；Extraction；Purification；Macroporous resin；Total flavonoids

漏蘆花为菊科植物祁州漏芦（Rhaponticum uniflorum（L.）DC）的干燥花，蒙药名字是洪古日朱勒，具有杀“粘”、止刺痛、清热解毒、解表等功能，一般用于肠刺痛、瘟热发症、结喉麻疹、毒热心热等[1-2]。漏芦花在蒙医临床中有较长的使用历史[3]，研究表明，漏芦花中含有黄酮、挥发油、植物甾醇、萜类等多种活性成分[4-9]，其中黄酮类具有明显的抗炎作用[10]和耐缺氧作用[11]。该试验以总黄酮含量为评价指标，优化漏芦花总黄酮的提取工艺参数和纯化工艺参数，以期为漏芦花抗炎有效部位的利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

UV-2550紫外分光光度仪（日本岛津公司）；Millipore MilliQ 超纯水制备仪（LABCONCO公司）；METTLER AG 285型电子天平（1/10万，瑞士梅特勒公司）；KD-300DE型数控超声波清洗器（昆山市仪器有限公司）；SHB-III型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；R1002-VN型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；SHSL调温电热套（上海树立仪器仪表有限公司）；容量瓶；树脂柱；D4020、AB-8、X-5、S-8、NKA-9、H103等型号大孔吸附树脂均购自南开大学化工厂。

1.2 试药

槲皮素（自制）；祁州漏芦花（河北康派中药材有限公司，批号101106）。无水乙醇（北京化工厂，分析纯）；三氯化铝（北京化工厂，分析纯）；无水醋酸钠（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；醋酸（北京化工厂，分析纯）；其他试剂为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 漏芦花总黄酮提取工艺优化。

1.3.1.1

对照品溶液的制备。精密称取槲皮素12 mg，60%乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶，得0.120 mg/mL对照品溶液。

1.3.1.2

供试品溶液的制备。精密称取2 g漏芦花粉末，加入75%乙醇溶液80 mL于圆底烧瓶中，称重，回流40 min，冷却至室温，再称重，75%乙醇补足重量，混匀，过滤，吸取续滤液2 mL于25 mL容量瓶中，定容。

1.3.1.3

显色方法与检测波长的选择。总黄酮类成分含量测定的显色方法主要有NaNO2-Al（ NO3）2-NaOH显色法、AlCl3-NaAc法和三乙胺法。分别参考文献[12-14]进行漏芦花总黄酮含量测定，并进行比较。

1.3.1.4

标准曲线的绘制。精密吸取对照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置于25 mL容量瓶中，分别加入1.5%氯化铝溶液8 mL和pH 5.4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液4 mL，摇匀后加入60%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，在常温下静置40 min，于413 nm处测定其吸光度值。以吸光度A为纵坐标、槲皮素浓度C（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线。

1.3.1.5

精密度试验。精密吸取0.12 mg/mL对照品溶液1 mL于25 mL容量瓶中，按照“ 1.3.1.4 ”操作，测定吸光度，重复试验6次。记录吸光度和RSD。

1.3.1.6 稳定性试验。精密吸取漏芦花供试品溶液1.0 mL于25 mL容量瓶中，按照“ 1.3.1.4 ”操作，分别于0、1、2、4、6、18、24 h测定样品中总黄酮含量并记录数据，计算RSD。

1.3.1.7

重复性试验。精密称取同一批次的漏芦花粉末，共6份，每份2 g，按照“ 1.3.1.2 ”制备供试品溶液，按照“ 1.3.1.4 ”操作，测定吸光度和RSD。

1.3.1.8 加样回收率。精密称取已知含量的漏芦花样品2 g，共6份，分别加入含槲皮素标品11.44 mg的标准溶液后，按照“ 1.3.1.2 ”制备供试品溶液，然后按照“ 1.3.1.4 ”方法测定吸光度，重复平行试验6次。计算回收率和RSD。

1.3.1.9

提取工艺正交试验。根据漏芦花中黄酮类化合物的理化性质，并结合实际生产需要，采用L9（34）不重复正交试验，确定考察提取因素为乙醇浓度、回流次数、回流时间、乙醇用量（倍量）。正交因素水平表见表1。取蒙药漏芦花粉末18份（分为9组，每组2份），每份5 g，精密称定，按表1进行试验。回流后滤液减压回收至100 mL，分别吸取1 mL于25 mL容量瓶中，按照“ 1.3.1.4 ”方法测定吸光度，计算总黄酮含量。

1.3.2 漏芦花总黄酮纯化工艺。

1.3.2.1

样品溶液的制备。称取漏芦花粉末200 g，按照优化的漏芦花有效部位提取工艺，收集并合并滤液，得漏芦花药液（总黄酮含量为4624.10 μg/mL）。

1.3.2.2 树脂的筛选。

（1）静态吸附性能比较。根据漏芦花总黄酮的理化性质和树脂吸附性能，选择D4020、H103、NKA-9、S-8、X-5和AB-8型大孔树脂进行静态吸附试验。取5种预处理好的树脂各5 g，分别置于50 mL具塞磨口锥形瓶中，各加入按提取最优工艺提取的漏芦花药液（1 g/mL）10 mL，于室温下搅拌放置8 h至吸附平衡，过滤，按氯化铝法测定滤液中总黄酮含量，计算吸附率。

（2）静态洗脱性能比较。将上述试验过程中已吸附漏芦花总黄酮的树脂过滤晾干，分别置于50 mL具塞磨口錐形瓶中，加入70%乙醇30 mL，于室温下搅拌洗脱8 h，过滤，按氯化铝法测定滤液中总黄酮含量，计算洗脱率。

1.3.2.3

泄漏曲线的绘制。取AB-8型大孔树脂约10 g，装入15 mm × 200 mm的树脂柱中，另取漏芦花样品溶液适量，加水稀释为0.2 g/mL，上树脂柱，上样流速为1.0 mL/min。每份10 mL，共收集14份，取适量溶液，按照“ 1.3.1.4 ”操作，测定吸光度，换算出相应的总黄酮含量。以漏芦花黄酮泄漏量（μg）为纵坐标、上样液体积为横坐标绘制泄露曲线。

1.3.2.4

洗脱剂浓度试验。取AB-8型大孔树脂10 g，分别装入4根15 mm×200 mm相同规格的树脂柱，按1 ∶9径高比装柱，另取漏芦花总黄酮提取液20 mL（按药材量与树脂用量比2 ∶1），加水稀释为0.2 g/mL，上树脂柱，上样流速为1.0 mL/min，待上样液流完后即吸附完成后，用3倍量去离子水除杂后，分别用30%、50%、70%、90%的乙醇溶液洗脱至洗脱液无色，洗脱流速为1.0 mL/min，收集洗脱液，减压浓缩后，定容至100 mL，过0.45 μm微孔滤膜，取过滤后的液体2 mL，按照“ 1.3.1.4 ”方法测定吸光度。

1.3.2.5

漏芦花总黄酮纯化正交试验。对上样浓度（g/mL）、上样pH、上样液流速（mL/min）、径高比进行L9（34）不重复正交试验。正交因素水平表见表2。取漏芦花总黄酮药液（1 g/mL）20 mL，分别稀释至0.05、0.10、0.20 g/mL。取AB-8型大孔树脂，装于试验用的9根树脂柱中，按表2进行试验，用3倍量去离子水除杂，然后用50%乙醇洗脱至近无色，收集洗脱液，减压浓缩至250 mL。取0.4 mL洗脱液按照“ 1.3.1.4 ”方法测定吸光度，计算其总黄酮含量。

1.3.2.6

洗脱剂用量。取漏芦花总黄酮药液（1 g/mL）20 mL，按上述所确定的纯化工艺操作，用50%乙醇洗脱液，每50 mL（1 BV）收集1份，共收集9份，减压干燥，分别测得每1 BV总黄酮量占充分洗脱后总黄酮量（充分洗脱后的总黄酮量为4015.38 μg/g）的百分比。

安徽农业科学 2017年

2 结果与分析

2.1 漏芦花总黄酮提取工艺优化

2.1.1

显色方法与检测波长的选择。测定方法的选择上，该试验分别比较了NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法、AlCl3-NaAc法和三乙胺法，结果表明AlCl3-NaAc法测定漏芦花总黄酮效果最好。加入NaAc-HAc缓冲液后，槲皮素最大吸收波长由360 nm移至410 nm，漏芦花供试品由340 nm移至413 nm。故选择413 nm作为试验测定波长。

2.1.2

标准曲线的绘制。按照“ 1.3.1.4 ”方法绘制标准曲线，得出回归方程为Y = 0.064X - 0.147（r= 0.999 2），表明槲皮素对照品在4.8～14.4 μg/mL线性关系良好。

2.1.3

精密度试验。按照“ 1.3.1.5 ”操作，得到精密度的RSD为1.7%，表明该方法的精密度良好。

2.1.4

稳定性试验。按照“ 1.3.1.6 ”操作，计算得RSD为1.7%，表明该方法在24 h内的稳定性良好。

2.1.5

重复性试验。按照“ 1.3.1.7 ”操作，测得RSD为14%，表明该方法的重复性良好。

2.1.6

加样回收率。由表3可见，槲皮素的平均加样回收率为98.4%，RSD为1.2%，表明该方法回收率良好，方法可行。

2.1.7

提取工艺正交试验。经方差分析可知，仅乙醇浓度对提取结果具有显著性影响，F=6.66>F0.05（2，2）=4.26，P<0.05。由表4可知，各因素对漏芦花中总黄酮提取量的影响从大到小依次为A、C、D、B，最佳提取方案为A3B3C1D1，即90%乙醇溶液，回流4次，每次回流时间30 min，乙醇用量10倍。考虑到实际生产中对成本和时间的要求，结合极差分析结果，确定提取的最优方案为A2B1C2D2，即75%乙醇溶液，回流2次，每次回流时间45 min，乙醇用量12倍。

2.1.8

提取工艺验证试验。精密称取漏芦花样品20 g，共3份，按优选的工艺条件进行提取，浓缩溶剂，定容至1 000 mL，分别精密吸取1 mL浓缩液于25 mL容量瓶中，按照“ 1.3.1.4 ”操作，测定吸光度，计算总黄酮含量分别为4 782.31、4 641.25、4 603.42 μg/g（以生药量计），RSD平均为12%，将浓缩液减压蒸干，测得干膏中总黄酮含量分别为78%、8.0%、79%。表明该提取工艺重复性良好。

2.2 漏芦花总黄酮纯化工艺研究

2.2.1 树脂的筛选。综合吸附率与洗脱率（表5）考虑，确定AB-8 型大孔树脂纯化漏芦花总黄酮。

2.2.2

泄漏曲线的绘制。以漏芦花黄酮泄漏量（μg）为纵坐标、上样液体积为横坐标绘制泄露曲线。由图1可知，漏芦花黄酮类化合物提取液的上样体积为100 mL时，总黄酮开始泄漏。

2.2.3

洗脱剂浓度的确定。从表6可看出，最终确定乙醇洗脱液浓度为50%。

2.2.4

漏芦花总黄酮纯化正交试验。经方差分析可知，仅径高比对纯化结果具有显著性影响，F=14.80>F0.05（2，2）= 4.26，P<0.05。由表7可知，各因素对漏芦花中总黄酮提取量的影响从大到小依次为D、A、C、B，纯化的最优方案为A1B3C1D3，即上样液浓度0.05 g/mL，上样液pH为5，上样液流速为1 mL/min，径高比为1 ∶9。考慮到实际生产中对时间的要求，且上样液流速对试验结果无显著性影响，故最终确定纯化的最优方案为A1B3C2D3，即上样液浓度0.05 g/mL，上样液pH为5，上样液流速为3 mL/min，径高比为1 ∶9。

2.2.5

洗脱剂用量。按照“ 1.3.2.6 ”操作，分别测得每1 BV总黄酮量占充分洗脱后的总黄酮量百分比分别为58.3%、18.7%、4.1%、1.5%、1.0%、0.9%、0.9%、0.8%、0.7%，故当50%乙醇洗脱5 BV时，可将总黄酮洗脱完全。

2.2.6

纯化工艺验证试验。取漏芦花总黄酮药液（1 g/mL）20 mL，共3份，按优选的工艺条件进行纯化，收集洗脱液，定容至250 mL，分别精密吸取1 mL浓缩液于25 mL容量瓶中，按照“ 1.3.1.4 ”漏芦花总黄酮含量，计算总黄酮含量分别为4 103.45、3 934.22、4 024.57 μg/g，RSD平均为2.2%，将浓缩液减压蒸干，测得干膏量，计算总黄酮含量，结果干膏中总黄酮含量分别为41.0%、43.6%、42.4%，RSD平均为31%。表明漏芦花总黄酮经AB-8型大孔树脂纯化后，较纯化前提高了5倍，且重复性较好。

3 讨论与结论

测定方法的选择上，该试验分别比较了NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法、AlCl3-NaAc法和三乙胺法，结果发现，第1种方法测定结果偏高，而加入三乙胺处理后标品峰并未发生红移或蓝移。池玉梅等[13]研究表明，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法并不是黄酮类化合物的专属反应，因为凡具有邻苯二羟基的物质，均能用此法进行显色测量；相反，AlCl3法测定时，黄酮类物质反应强烈，而对酚酸类、原花色素的反应很小，因而对黄酮类化合物的专属性较强。故该试验采用AlCl3-NaAc法。

提取方法预试验中，采用了超声提取法、回流法和冷浸法，提取的总黄酮分别为5 522.3、5 901.5和4 003.8 μg/g，故该试验中使用回流法。

考虑到工业生产中对洗脱剂的毒性要求和生产成本，该研究选择乙醇作为洗脱剂。

上样液浓度考察中发现，样品液浓度越高，洗脱过程中流速变缓和柱床堵塞的情况越严重，可能是浓度过高导致物质析出，沉淀中也含有较多的黄酮类物质，故采取直接过滤的方法会造成总黄酮的损失。该试验采取先稀释后过滤的方法，柱床堵塞明显改善，且沉淀中黄酮类物质含量显著减少。

正交试验表明，各因素对漏芦花总黄酮提取量的影响从大到小依次为乙醇浓度、回流时间、乙醇用量、回流次数，确定提取的最优方案为75%乙醇溶液，回流2次，每次回流时间45 min，乙醇用量12倍。应用AB-8型大孔吸附树脂对漏芦花总黄酮进行富集，通过正交试验等确定其最佳纯化工艺为：上样液浓度0.05 g/mL，上样液pH为5，上样液流速为3 mL/min，径高比为1 ∶9。该研究为漏芦花提取纯化工艺提供了依据，也为漏芦花抗炎有效部位的开发奠定基础。

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