寒地水稻纹枯病菌形态特征及ITS鉴定

李修平 马文东 常玮 宋成艳 赵雪 张丽敏

摘要 [目的]分离鉴定寒地水稻纹枯病病原菌，为寒地水稻纹枯病抗性育种提供技术支持和理论依据。[方法]采集水稻纹枯病病株并分离培养病菌，采用柯赫氏检验法和ITS鉴定的方法，对分离菌株进行形态观察和分子生物学鉴定。[结果]将分离获得病菌以牙签嵌入法接种水稻植株，植株呈现水渍状典型纹枯病病斑。利用ITS1和ITS4引物扩增病菌DNA，测序结果拼接后与NCBI上已知序列比对，结果表明该菌与登录号为No.KT362083.1的Rhizoctonia solani（立枯丝核菌）有97%的同源性。[结论]形态学特征鉴定与分子生物学鉴定结果一致，该菌为立枯丝核菌，为寒地水稻纹枯病致病菌。

关键词 寒地水稻；纹枯病菌；形态观察；ITS鉴定

中图分类号 S435.111.4+2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）04-0156-03

Morphological Observation and ITS Identification on Rice Sheath Blight （Rhizoctonia solani）in Cold Region

LI Xiu-ping1，MA Wen-dong2，CHANG Wei3 et al （1.School of Life Sciences，Jiamusi，University，Jiamusi，Heilongjiang 154007；2.Jiamusi Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Jiamusi，Heilongjiang 154026；3.Key Laboratory of Soybean Biology of Chinese Education Ministry，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150030）

Abstract [Objective] Strain of rice sheath blight in cold region was isolated，and identificated in order to provide technical support and theoretical basis for rice sheath blight resistance breeding.[Method] Diseased plants from rice sheath blight were collected，and strain was isolated and cultured.Morphological observation and molecular identification on strain were carried out by using the method of Koch′s test and ITS identification.[Result] The isolated strain inoculated rice plants with toothpick embedding method，the plants showed hygrophanous typical sheath blight spots.ITS1 and ITS4 primers were used to amplify the strain DNA，sequencing results were compared with known sequences on NCBI，Blast searches results showed a high identity with reference sequences（ITS：97%）.Representative sequences of both regions were deposited to GenBank（ITS：Accession No.KT362083.1）.[Conclusion] Morphological and molecular results confirm this strain as Rhizoctonia solani，the strain is the pathogens of rice sheath blight.

Key words Rice in cold region；Rhizoctonia solani；Morphological observation；ITS identification

水稻紋枯病是由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的世界性水稻病害。在我国长江流域和南方稻作区，水稻纹枯病已成为危害严重的主要水稻病害之一[1]。20世纪90年代后，由于寒地稻作区施肥水平不断提高，加之纹枯病菌寄主广泛、优秀抗源获得较少等原因，寒地水稻纹枯病造成的产量损失日益严重，水稻纹枯病已成为影响寒地稻作区水稻生产的上升性主要病害之一[2]。

目前，寒地水稻纹枯病研究多集中在药剂防治方面[3-6]，也有少量关于寒地水稻纹枯病发病规律的研究报道[2，7-9]，寒地水稻纹枯病的遗传研究和育种工作进展较缓慢。使用药剂防治水稻纹枯病效果一般，而且污染环境、提高农民生产成本，培育抗病优质寒地水稻品种是根本解决办法。抗性鉴定是寒地水稻纹枯病抗性育种的首要工作，而分离和鉴定寒地水稻纹枯病病原菌是抗性鉴定的前提。真菌性病害的鉴定方法，传统上是通过对其形态特征、生物学和生理学、致病性特征进行描述。随着生物技术的发展，同工酶、可溶性蛋白电泳、血清学技术、分子标记技术以及rDNA-ITS序列分析技术不断在病原菌鉴定和遗传学分析中广泛应用[10]。rDNA-ITS是目前分子系统性广泛采用的标记基因之一，近年来rDNA-ITS序列分析技术因其两侧编码区的高度保守性及操作方法简便、鉴定结果准确等特点而被应用于各类真菌性病害的分类鉴定和遗传多样性分析中[11-14]。笔者通过形态学特征观察和ITS鉴定的方法，对采集于寒地的水稻纹枯病病株进行了病原菌分离与鉴定，以期为寒地水稻纹枯病抗性育种提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 水稻纹枯病菌。2014年采集于黑龙江省农业科学院佳木斯水稻研究所纹枯病发病植株，于黑龙江省农业科学院佳木斯分院病理研究室进行分离培养保存[15]。

1.1.2 病菌接种植物材料。收集30份寒地水稻种质资源，采用大田管理，每个品种种植2行，行长1 m；旱育秧，插秧规格为30 cm×10 cm。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化及形态特征观察。

采集水稻纹枯病发病植株，采用常规组织分离法，从发病叶鞘的病健交界处进行分离。分离得到的菌株经纯化后在PDA上进行培养和形态观察，并置于0～4 ℃冰箱保存备用。

将编号SB-2的菌株置于PDA平板上，于光照培养箱中进行28 ℃光暗交替培养，观察菌落、菌核形态特征，生物显微镜下观察菌丝形态，参考文献[16]进行病原菌鉴定。

1.2.2 致病性测定。

按照柯赫氏法则，对健康的寒地水稻种质资源进行接种，并设无伤对照，对分离菌株进行致病性测定。接种方法参照潘学彪等[17]提出的牙签嵌入法，将木质牙签剪成长0.8～1.0 cm的小段，铺于培养皿底部，加入适量PDA培养基，覆盖牙签以厚度0.5～1.0 cm为宜，121 ℃高压灭菌15 min，接种，28 ℃培养3～5 d，待菌丝密集地布满培养基时进行田间接种，每个品种接种3株，每稻丛接种3个茎秆，并挂标签。用镊子将短牙签自上向下嵌入接种茎秆第2～3叶鞘，由于该2个叶鞘不再伸长，并且接种后叶鞘抱茎状态未被改变，故植株呈自然状态。

1.2.3 病原菌再分离。

从接种后发病水稻植株叶鞘上分离培养病原菌，对其形态特征与最初接种病原菌菌株进行比较。

1.2.4 病原菌的ITS鉴定分析。

1.2.4.1 病原菌DNA提取。在PDA固体培养基上接种病原菌，置于28 ℃培养7 d，刮取菌丝或菌核，采用CTAB法提取病原菌基因组DNA。

1.2.4.2 病原菌rDNA-ITS序列分析。采用真核生物核糖体 DNA 通用引物 ITS1/ITS4 进行扩增。序列：ITS1，5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4，5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR 反应体系（25.00 μL）：5 mmol/L MgCl2 2.50 μL，10×buffer 2.50 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.00 μL，20 μmol/L引物0.25 μL，10 U/μL Taq 聚合酶0.25 μL，15 ng/μL模板DNA 3.00 μL，ddH2O 15.50 μL。

PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性 1 min，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，循环30次；72 ℃延伸 10 min。阴性对照用 ddH2O 代替模板 DNA，PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。检测后，将扩增的菌株 PCR 产物送黑龙江博凯实验设备有限公司进行正反向双向测序。

1.2.4.3 序列比对分析。将PCR测序结果利用DNAMAN软件进行处理，获得DNA序列与NCBI数据库上已知序列比对分析，进行病原菌的同源性分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌的形态学特征

菌株SB-2在PDA培养基上28 ℃培养4 d后，菌落可长满皿，菌丝生长迅速，菌丝体初期无色，后期变淡褐色，分枝与主枝呈锐角或直角，分枝处有缢缩。成熟菌核淡褐色至褐色，半球形或类球形，菌核表面常有黏液分泌，常多个菌核聚合成团，菌核呈深褐色圆形或不规则形，较紧密（图1）。

2.2 菌株SB-2的致病性

菌株SB-2采用成株期牙签嵌入法，于水稻植株分蘖末期接种于30份寒地水稻种质资源，接种36 d后调查，接种水稻植株在近水面的叶鞘上出现水渍状椭圆形斑，为水稻纹枯病典型病斑特征（圖2）。将接种后发病水稻植株进行病原菌的再次分离培养，获得与原菌株形态一致的病原菌。对照植株未表现出纹枯病发病症状。根据柯赫氏法则，菌株SB-2为水稻纹枯病致病菌。

2.3 水稻纹枯病ITS序列分析鉴定

利用ITS通用引物对病原菌菌株SB-2提取的基因组DNA进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测获得750 bp的片段，回收该片段并双向测序，测序结果处理后与NCBI数据库进行Blast比对，在GenBank中已知序列进行同源性分析，发现该病原菌ITS序列与登录号为KT362083.1的立枯丝核菌（Rhizoctonia solani AG-1-IA）同源性高达97%，表明该菌为Rhizoctonia solani，为寒地水稻纹枯病致病菌。

3 结论与讨论

对2014年采集的水稻纹枯病发病植株进行病原菌分离培养并获得菌株SB-2，通过形态特征观察、柯赫氏法则致病性鉴定，接种该菌株后水稻植株呈现纹枯病水渍状病斑，表明该菌株为寒地水稻纹枯病致病菌；采用rDNA-ITS序列进行分子鉴定，菌株SB-2序列与登录号为No.KT362083.1的立枯丝核菌（Rhizoctonia solani AG-1-IA）同源性高达97%，该菌株为寒地水稻纹枯病致病菌，形态特征鉴定结果与ITS分子鉴定结果一致。

传统的真菌分类鉴定主要依靠真菌的形态特征及生理生化特征等描述，但由于其种类众多、个体多态性差异明显等原因，常会出现假阳性或假阴性结果[18]。随着分子生物学的迅速发展，真菌的分类中引入了rDNA-ITS序列分析技术，核糖体DNA转录间隔序列进化速度快、种间变异丰富，该技术具有操作简便、特异性好、结果准确、GenBank和EMBL数据库储存大量序列信息可供查询等特点，被广泛应用于病原菌的鉴定及分类、遗传多样性等研究[19-20]。

融合菌群测定是目前丝核菌分类的另一有效方法，可获得菌的种属鉴定甚至是亚类的鉴定结果，但具有菌丝融合现象复杂、融合标准难以判断准确、鉴定过程复杂、时间长等缺点[21]。将ITS快速分子鉴定方法与融合菌群分类细致准确的测定方法相互结合、相互验证，能够更加准确有效地开展病原菌鉴定工作。

水稻纹枯病对寒地水稻生产危害不断加重，而关于寒地水稻纹枯病病原菌鉴定分离的研究鲜见报道，确定寒地水稻纹枯病病原菌分类及获得病原菌菌种，对于寒地水稻纹枯病抗性育种具有重要意义，可为其提供抗性鉴定技术工具，为寒地水稻纹枯病遗传、发病规律研究及防治提供理论依据。

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