南五味子果实多糖和脂溶性物质抗菌抗氧化作用研究

林雄平 林彬彬 卓雄标 苏巧玲 彭彪

摘要 [目的]研究南五味子果实多糖和脂溶性物质的抗菌抗氧化作用。[方法]采用水提取法、乙醚索氏提取法，分别提取南五味子果实多糖和脂溶性物质，并对其抗菌作用、抑制羟自由基能力进行研究，并初步鉴定果皮脂溶性物质的化学成分。[结果]南五味子果皮、果肉的脂溶性物质对金黄色葡萄球菌有抗菌作用，抑菌圈分别为19.39、18.28 mm；南五味子果皮、果肉、种子的脂溶性物质对枯草芽孢杆菌有抗菌作用，抑菌圈分别为32.87、19.54、7.52 mm。南五味子多糖、果肉和种子的脂溶性物质，抑制羟自由基能力分别为4 011.48、3 079.01、1 082.66 U/mL。[结论]南五味子果实具有较强的抑菌作用及抑制羟自由基能力。南五味子可作为一种野生水果开发。

关键词 南五味子；果实；抗羟自由基；抗菌；多糖；脂溶性物质

中图分类号 S789.5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）04-0119-03

Study on the Antimicrobial and Antioxidant Activities of Polysaccharide and Liposoluble Substance from Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep Fruit

LIN Xiong-ping1，2，LIN Bin-bin1，ZHUO Xiong-biao3 et al （1.Department of Biology，Ningde Normal University，Ningde，Fujian 352100；2.Engineering Technology Center of Fujian Characteristic Medicinal Plants，Ningde，Fujian 352100；3.Department of Assets and Logistic Management，Ningde Normal University，Ningde，Fujian 352100）

Abstract [Objective] To study the antimicrobial and antioxidant activities of polysaccharide and liposoluble substance from Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep fruit.[Method] The antibacterial activity and inhibition of hydroxyl free radical were studied on K.longipedunculata fruit though the method of water extraction and ethyl ether soxhlet′s extraction，and the chemical composition of peel lipid soluble substances were identified preliminarily.[Result] The results were as follows，lipid soluble substances from K.longipedunculata peel and flesh had antibacterial effect on Staphylococcus aureus and inhibition zone were 19.39，18.28 mm respectively.The inhibition zone of lipid soluble substances from K.longipedunculata peel and flesh and seed against Bacillus subtilis were 32.87，19.54，7.52 mm respectively.Antihydroxyl radical ability of polysaccharides and fat soluble extraction of flesh and seed fat soluble extraction were 4 011.48，3 079.01，1 082.66 U/mL.[Conclusion] K.longipedunculata has strong antibacterial activity and inhibition of hydroxyl radical capacity.K.longipedunculata can be developed and utilized as wild fruit resources.

Key words Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep；Fruit；Inhibition of hydroxyl free radical；Antibiosis；Polysaccharide；Fat soluble substances

南五味子（Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep），俗称土木香、紫荆皮、小血藤[1]，集中在黄河流域以南，我国是南五味子的原产地，主要分布于云南、贵州、四川、广东、广西、福建等省[2]。南五味子为名贵常用中药材，其药用部位主要是藤和根，具有补血活血、祛风除湿的功效[3]。刘丽等[4]研究南五味子不同溶剂提取物抑菌活性及其组分性质发现，南五味子水及乙醇提取物对8种致病菌均有良好的抑制作用，南五味子乙醇提取物含有黄酮、多酚、甾体、三萜、生物碱、香豆素与内酯等。南五味子乙醇提取物对食品腐败细菌具有显著的抑菌活性[5]。另外，南五味子提取的木脂素可结合失眠大鼠的5-HT1A受體，作为一个潜在的5-HT1A受体激动剂药物[6]。南五味子的果实提取物可作为γ-氨基丁酸受体的调节剂，提高增强γ-氨基丁酸受体上的氯电流[7]。但目前尚未见到有关乙醚为溶剂提取南五味子并进行抑菌活性、抗自由基能力的研究及其组分性质鉴定、开发与综合利用等方面的研究报道。笔者对南五味子果皮、果肉、种子分别进行乙醚溶剂提取脂溶性物质，将提取物进行抗菌作用、抗羟自由基能力研究，再对抗菌作用最强的成分进行化学成分分析，为南五味子作为食药两用水果研究开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试材

南五味子果实采自福建省宁德市屏南县南五味子种植园，采摘后将成熟果实去除杂质，淘洗，沥干，晾干，鲜果装于塑料袋中，置于4 ℃冰箱中保存备用。部分鲜果自然风干或35 ℃烘干后，分别剥取果皮、果肉和种子，以及一整串南五味子研磨成粉，过40目筛，备用。

1.2 菌种 细菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus Rosenbach）、枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis（Ehren-berg）Cohn]、大肠杆菌[Escherichia coli （Migula） Casleillni and Chalmers]。真菌：啤酒酵母（Saccharomyces carlsbergensis Hansen）、黑曲霉（Aspergillus nige v.Tiegh）。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取。采用

水提取法。取一整串南五味子粉末15 g，精密称定，置于蒸馏瓶中，加蒸馏水150 mL，连接进出水口，下进水，上出水，则进出水口的另一端与低温冷却液循环泵相连。在加热炉上100 ℃回流8 h，将蒸馏瓶中回流所得物离心（3 000 r/min，25 ℃），保留底层水提取液，再将水提取液蒸发，即可得到水提取法所提取的多糖物质，置于4 ℃冰箱保存，待用。

1.3.2 脂溶性物质的提取。采用乙醚索氏提取法。精密称定南五味子果皮粉末20 g、果肉粉末8 g、种子粉末20 g，分别用滤纸包扎结实，并在封口处系上白色细绳，防止果皮粉末从包扎袋中冲刷出来，而堵住索氏提取器的虹吸管；分別将装有粉末的包扎袋置于提取管中，最高部位不得与提取管最上部液体出口等高或更高；冷凝管下端口与进水管相连，上端口与出水管相连，而进出水管的另一端与低温冷却液循环泵相连；加乙醚300 mL于提取瓶中，于60 ℃索氏提取10 h；挥发干溶剂，即得南五味子果皮、果肉、种子在乙醚中的脂溶性物质，置于4 ℃冰箱保存，待用。

1.3.3 提取物抗菌效果测定。

配置好的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基同培养皿、无菌水、玻璃珠等放入手提式压力蒸汽灭菌器中121 ℃，分别灭菌20、30 min，80 ℃恒温箱干燥培养皿，将接种环、培养皿、无菌水、玻璃珠等放入无菌操作台，紫外灭菌30 min以上，打开风机运转10 min。双手及双臂用70%酒精消毒再进行无菌操作，待培养基冷却到一定程度，未凝固时，将各菌种分别用接种环接种到5瓶无菌水中，倒入数颗玻璃珠摇匀，将稀释的菌水分别倒入5瓶不同的培养基中混匀，并将每瓶带有菌种的培养基倒入培养皿中，每皿20～25 mL，静置冷却制成平板，做好标签，待冷却凝固后分别贴上沾有浓度5 mg/mL样品和空白对照的滤纸片，设3个重复组，然后将金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌倒置在37 ℃的培养箱培养18 h，啤酒酵母、黑曲霉培养基倒置在28 ℃的培养箱培养24 h后，观察各组分的菌种生长状况，并测定抑菌圈的直径大小。

1.3.4 提取物对抑制羟自由基能力的测定。

1.3.4.1 试剂组成与配制。①0.03%H2O2标准应用液的配制：3%H2O2标准贮备液∶双蒸水=1∶99稀释，现用现配。②底物应用液的配制：底物贮备液∶双蒸水=1∶99稀释，现用现配（样本为抑制羟自由基，即测定管吸光度比对照管吸光度低）。③试剂3应用液∶甲液应用液与乙液等比例混合，按需配制，余下4 ℃保存。④显色剂的配制：试剂4应用液∶试剂5∶试剂6∶冰乙酸=8∶3∶3∶2，现用现配。其中，试剂3、4、5、6来自抑制羟自由基测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3.4.2 羟基自由基能力的测定。以上配制好的应用液，先在37 ℃水浴中预温3 min，混匀在37 ℃水浴中进行。

将表1中空白组的各溶液混匀，37 ℃反应1 min，从加完试剂3应用液开始到1 min结束，立即加入显色剂终止反应，1次只做1根试管。其他组各溶液混匀，室温放置20 min，在550 nm、1 cm光径、双蒸水调零条件下，测定各管吸光度值。

抑制羟自由基能力=对照OD值-测定OD值标准OD值-空白OD值×标准品浓度×1 mL 取样量×样品测试前稀释倍数式中，抑制羟自由基能力单位为U/mL；标准品浓度为8.824 mmol/L；样品测试前稀释100倍。

1.3.5 色谱-质谱（GC-MS）法分析果皮脂溶性物质的化学成分。

Vrian450-GC/240-MS气相色谱质谱联用仪对南五味子果皮各化合物进行分离和结构分析，色谱柱为VF-5MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm弹性石英毛细柱，进样口温度280 ℃，传输线温度250 ℃，离子源温度230 ℃，流量1 mL/min，载气为氦气；柱温程序：从初始温度60 ℃开始，以15 ℃/min的速度加热，在15 min内加热至280 ℃；离子源为EI，质量扫描范围40～500 amu，扫描方式SCAN/FULL，进样量1.0 μL。

2 结果与分析

2.1 南五味子果实多糖脂溶性物质的提取 从表2可看出，水提取法主要是提取南五味子果实的多糖物质，南五味子果实的多糖提取高达43.3%，说明南五味子是一种含糖量较高的聚合浆果。乙醚索氏提取法，主要提取脂溶性物质，南五味子脂溶性物质提取果皮提取率3.5%、果肉提取率2.0%、种子提取率40.7%，三者相比较，种子脂溶性物质含量最高，可见种子营养物质含量最高。

2.2 南五味子果实提取物抗菌效果 由表3可知，南五味子果实脂溶性物质对2种细菌有抑制作用，其中，南五味子果皮脂溶性提取物的抗菌效果最好，最大的抑菌圈可达32.87 mm。金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌对果皮中脂溶性物质最为敏感，而对种子中脂溶性物质敏感度相对比较弱或几乎不敏感；枯草芽孢杆菌比金黄色葡萄球菌对果皮的脂溶性提取物更为敏感，所以枯草芽孢杆菌的抑菌圈更大。乙醚脂溶性物质的提取对G+菌有抑菌作用，对G-菌、真菌无抑菌作用。

2.3 南五味子果实提取物抑制羟自由基能力

试验结果表明，南五味子多糖、果肉脂溶性物质和种子脂溶性物质均有抑制羟自由基能力，其中多糖抑制能力最强，抑制能力高达4 011.48 U/mL，而果皮脂溶性物质的结果为负数，因此没有抑制羟自由基能力。抑制羟自由基能力由大到小依次为多糖、果肉脂溶性物质、种子脂溶性物质、果皮脂溶性物质。南五味子果实抑制羟自由基能力强，因此可以对南五味子果实的抗氧化性进行更深入的研究。

2.4 果皮脂溶性物质的化学成分

对南五味子果皮脂溶性物质的总离子流图（图1）进行分析鉴定，经计算机谱库检索，对检索结果与标准质子图核对，初步确定了南五味子果皮脂溶性物质的11种成分，其主要有8种：亚硫酸己十四酯、氯代十八烷、2，6-二异丙基萘、正十九烷、（-）-α-蒎烯、1-碘四十八烷、正十六烷、N，α-二甲基苯乙胺。

3 讨论与小结

南五味子果实为聚合浆果，挂果量大，平均一串有50～60颗，果核具观赏价值，成熟果可生食，植物的果实与北五味子有所不同[8]，化学成分也有所差异[9]。南五味子是我国传统药材之一，被我国卫生部颁布为可用于保健食品的物质[10]。

该试验对南五味子果实进行多糖、脂溶性物质的提取，采用水提取法提取多糖，粗提取率为43.3%，与谭晓虹等[11]报道的南五味子超声波提取多糖含量（8.7%）相比，南五味子果实的水提取多糖的含量高于超声波提取多糖的含量，可见水提取法提取多糖效果更佳。采用乙醚索氏法提取脂溶性物质，总粗体率46.2%，与刘丽等[4]报道中的南五味子乙醇提取率（34.2%）、乙酸乙酯提取率（67.1%）、石油醚（67.0%）相比，南五味子果实溶于乙醚中的物质大于溶于乙醇中的物质，可见南五味子果实中脂溶性物质含量较高。

南五味子果實各部位的乙醚提取，得到的脂溶性物质进行抗菌试验。刘丽等[4]研究发现，整串果实提取物质量浓度100 mg/mL的溶液对金黄色葡萄球菌抑菌圈分别为乙醇提取物26.17 mm、乙酸乙酯提取物17.35 mm，石油醚提取物无抑菌作用；对枯草芽孢杆菌抑菌圈分别为乙醇提取物19.14 mm、乙酸乙酯提取物14.37 mm，石油醚提取物无抑菌作用。该试验测试溶液的质量浓度为5 mg/mL，南五味子果皮、果肉的乙醚提取物对金黄色葡萄球菌抑菌圈分别为19.39、18.28 mm；果皮、果肉、种子的乙醚提取物对枯草芽孢杆菌抑菌圈分别为32.87、19.54、7.52 mm，与刘丽等[4]研究结果相比，乙醚提取物抗菌效果均强于乙醇、乙酸乙酯、石油醚提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌效果。可见，乙醚提取物中果皮脂溶性物质抗菌效果最好，抑菌圈最大的可达32.87 mm。

近年来随着医学的发展，有关预防和治疗自由基诱发的疾病和抗衰老的研究应用前景广泛。该试验通过体外抗氧化试验，对提取物采用紫外分光光度法进行测定。与赵春苏等[12]研究的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇的超声波提取物的清除自由基能力相比，水提取的多糖抑制羟自由基能力均强于超声波提取物抑制羟自由基能力。可见，南五味子果实水提取法提取的多糖物质体外抗氧化活性更好，可作为天然的抗氧化、预防衰老的食药两用资源进行开发。

研究抗菌效果最好的果皮脂溶性物质成分，初步确定了南五味子果皮脂溶性物质的8种主要成分，与卓雄标等[13]研究的南五味子种子油的主要9种成分[反式-橙花叔醇、δ-榄香烯、香树烯、乙酸冰片酯、（+）-苜蓿烯、（+）-γ-古芸烯、香叶基香叶醇、S-（Z）-3，7，11-三甲基-1，6，10-十二烷三烯-3-醇、10-二十一（碳）烯]相比，果皮中的脂溶性物质均不相同，可见，南五味子果皮中的物质与种子中的物质差别较大。因时间问题，该研究仅通过与标准图谱核对初步确定其成分，因此在之后的试验中可深入研究，确定南五味子果皮更为具体的成分。

参考文献

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