超高效液相色谱-串联质谱法对蜂蜜中土霉素残留的检测

单乃荣孙 甜罗昭军陈 幸韦 纬班燕桃吴 涛叶云锋唐 建李锦泉贺敏华

（1.广西兽药监察所，广西南宁 530001；2.广西养蜂指导站，广西南宁 530022）

超高效液相色谱-串联质谱法对蜂蜜中土霉素残留的检测

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（1.广西兽药监察所，广西南宁 530001；2.广西养蜂指导站，广西南宁 530022）

建立了蜂蚩中土霉素药物残留检测的超高效液相色谱_串联质谱检测方法。以McIlvajne_Na2EDTA缓冲液为提取液，经HLB固相萃取小柱净化，脱溶剂后用甲醇水溶解，在超高效液相色谱_串联质谱上进行检测。土霉素在0～200ng·ml_1浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数R2＞0.999。添加药物水平40～200μg·kg_1的回收率在65.1～98.7%。土霉素的检测限为5μg·kg_1，定量限为10 μg·kg_1。方法快速简便，准确可靠，重现性好，可用于监测蜂蚩中土霉素的含量。

；蜂蚩；土霉素；超高效液相色谱_串联质谱法

土霉素是最常用四环素类广谱抗生素药物之一，具有防治见效快，价格低廉，容易购买的特点，作为兽药和饲料添加剂在食品动物中广泛应用。土霉素被非法用于养殖过程中蜂群病虫害的治疗和预防，剂量过大或疗程过长，造成土霉素药物残留除了其毒副作用对人直接危害外，更为严重的是动物性食品中残留容易诱导人类致病菌产生耐药性，从而不利于该类药物在人类疾病的治疗[1～3]，因此必须十分重视土霉素在动物性食品中的残留问题。在历年国家蜂产品质量安全通报中均有检出，使得土霉素在蜂产品中的药物残留越来越受到关注。目前已发布的 GB/T18932.23-2003《蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定方法液相色谱－串联质谱法》[4]中净化需要两种小柱，处理过程较多，易造成损失，回收率不理想；农业部1025号-12-2008《鸡肉、猪肉中四环素类药物残留检测 液相色谱－串联质谱法》[5]，由于受蜂蜜样品基质影响分析结果较大，也不适用。我们通过饲喂试验，考察土霉素在蜂蜜中的代谢过程，并对样品前处理和仪器条件进行研究，改进后的方法快速简便，准确可靠，重现性好，为有效监控蜂蜜样品中土霉素药物残留提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器 超高效液相色谱-串联质谱仪（美国Waters，TSQ QUANTUMACCESS，配有电喷雾电离源）；N-EVAP 112氮吹仪，美国Organomatian assocaiate公司；3K15高速冷冻离心机，美国Sigma公司；HY-54回旋振荡器，国华电器有限公司；精密pH计，梅特勒公司；Mettler AE 240分析天平（感量0.0001 g）；Mettler PL602-S电子天平（感量0.01 g）；美国Waters固相萃取装置。

1.1.2 试剂 土霉素对照品来自中国兽医药品监察所，批号为K0031208，含量89.5%；有效期未标示；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）；氢氧化钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、甲酸；水为实验室一级水；HLB固相萃取柱，60 mg，3cc，美国Waters公司。

1.1.3 制备试剂 氢氧化钠溶液（1.0 mol·L-1）：称取氢氧化钠1 g，加水溶解并稀释至100 mL；McIlvaine-Na2EDTA缓冲液：分别取柠檬酸12.9 g，磷酸氢二钠10.9 g，乙二胺四乙酸二钠37.2 g，加水900 ml溶解，用1.0 mol·L-1氢氧化钠溶液调pH至4.0±0.5，加水稀释至1000 ml；0.1%甲酸水溶液，取1 ml甲酸用水稀释至1000 ml。

1.2 阳性样品制备

通过人为在花粉和蜂蜜中添加药物饲喂至蜂群，选用“药物+蜂蜜”、“药物+花粉”两种方式进行平行试验；用药量为常规用量的2倍（参照成人用药量饲喂10脾蜂为常规用量），喂药7、21、45日后取蜜检测。

1.3 对照品溶液制备

土霉素标准储备液的配制：取土霉素对照品适量，精密称定，按土霉素计，用甲醇溶解并稀释成浓度为1mg·ml-1的溶液，作为标准储备液。置-20℃冰箱中保存，有效期为1个月。

土霉素标准工作液的配制：准确量取适量标准储备液，用初始流动相稀释成适宜浓度的土霉素标准工作液。临用前配制。

1.4 试验方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱为WATERS ACQUITY UPLC BEH C18柱 100 mm×2.1 mm，粒度1.7 µm；色谱柱温30 ℃；流速0.25 ml·min-1；进样量2µl；流动相为A：0.1%的甲酸水溶液，B：乙腈，采用梯度洗脱：0 min～6 min，90%A线性变化至62%，6～7 min，62%A线性变化至90%A，7 min～9 min，90%A。

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子化，正离子检测，喷雾电压4000 V，离子传输管温度400 ℃，鞘气流速15 L·min-1，碰撞气为氩气，定性离子对、定量离子对及碰撞能量的参考值见表1。

表1 土霉素的质谱条件

1.4.3 定性与定量 该方法定性满足四个条件：①试剂空白和样品空白不能出现与阳性对照相同的离子峰；②特征离子色谱峰的信噪比（S/N）都在3：1以上；③试样溶液色谱峰保留时间，应与校正溶液的一致，允许偏差为±2.5%；④试样溶液离子丰度比应与校正溶液一致，定量时以响应强度最强离子作为定量离子对进行计算。

1.4.4 标准曲线的绘制 依次准确移取标准工作液适量，用空白样品提取液稀释成浓度为土霉素0、10、20、40、60、100、200 ng·mL-1的系列标准溶液，由低浓度到高浓度进样，按照液相色谱条件分析，以色谱峰面积为纵坐标，对应标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.4.5 样品溶液的前处理 称取（2±0.05）g样品，置10 ml容量瓶中，加入McIlvaine-Na2EDTA缓冲液至刻度，充分混匀，振摇30 min，9000 r·min-1离心10min，温度低于10 ℃，备用。

精密量取备用液5 ml过HLB小柱（用甲醇、水各5 ml预洗活化），用水、5%甲醇水溶液各5 ml淋洗，减压抽干。用甲醇5 ml洗脱，减压抽干，收集洗脱液，洗脱液用水浴氮气吹干（温度低于40℃），用0.1%甲酸水1 ml充分溶解残余物，过滤膜后作为试样溶液，供超高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4.6 灵敏度确定 将适量药物加入到空白蜂蜜中，制成2、5、10µg·kg-1的三个浓度添加样品，经上述方法进行处理后，用LC－MS/MS检测。观察药物特征离子质量色谱峰的信噪比（S/N）和对应药物浓度，（S/N）＞3者定其为方法检测限；（S/N）＞10者定为其方法定量限。

1.4.7 准确度和精确度的确定

采用标准添加方法，取土霉素标准工作液适量，分别添加到空白蜂蜜中，制得浓度为40、100、200 µg·L-1的系列空白添加试料（低、中、高三个浓度），每个浓度做6个平行试验，重复3次，求批内批间相对标准偏差。

表2 蜂蜜中添加土霉素的精密度、回收率试验测定结果

2 结果与分析

2.1 标准曲线

按照上述配制方法，土霉素在0～200 ng·mL-1的浓度范围内线性关系良好，得回归方程为y=18341x+10106，相关系数R2＞0.999。

2.2 方法灵敏度

按上述方法进行处理，结果显示方法检测限为5µg·kg-1，定量限为10µg·kg-1。空白蜂蜜、空白蜂蜜添加土霉素的总离子流图（Total Ion Current，TIC）和特征离子质量色谱图见图1、2。

2.3 精密度和回收率试验

按上述1.4.5方法进行处理，分别计算批内和批间精密度和回收率结果见表2。该方法准确度较高，回收率65.0%以上，批内变异系数小于12%，批间变异系数小于3%。

2.4 分组饲喂土霉素实验的检测结果

分组饲喂土霉素，不同方式在不同时间点的蜂蜜中土霉素浓度的实验的检测结果见表3，从表中可看出蜂蜜在给药7d后，土霉素+蜂蜜给药方式土霉素药物浓度最高为820×10 µg.kg-1，土霉素+花粉方式45d的土霉素药物浓度最小为2.38 µg.kg-1。蜂蜜中土霉素没有杂质干扰且峰形良好，具体见图3。

表3 饲喂土霉素含量测定结果

图1 空白蜂蜜样品溶液TIC和特征离子色谱图

图2 空白样品添加土霉素对照品溶液TIC和特征离子色谱图（10 μg·kg-1）

图3 饲喂土霉素的蜂蜜样品溶液TIC和特征离子色谱图

2.5 色谱条件的优化

本方法比较了甲醇和乙腈、水和0.1%、0.3%甲酸水溶液作为流动相对分离的影响。在C18色谱柱上乙腈的分离度优于甲醇，甲醇水溶液优于水。结果0.1%甲酸水和乙腈梯度洗脱对样品进行分析，土霉素色谱峰形对称性良好。

3 讨论

3.1 前处理方法的优化

本方法通过对样品前处理条件的充分优化改进，建立了适用于蜂蜜中土霉素药物残留检测的UPLC－MS/MS方法。与GB/T 18932.23-2003比较，该检测方法快速、简便、结果可靠，灵敏度和精确度均能满足兽药残留分析方面的要求。

3.2 安全风险

通过此次试验，同剂量药物的两种喂药方式在蜂蜜中均检测出高浓度药物，蜂蜜中土霉素放置时间的延长，药物浓度明显地消减，45天后检测结果显示仍然有残留，说明无论是“花粉+药物”还是“蜂蜜+药物”的用药方式，均会造成产品污染，影响产品安全，并且代谢时间长，养殖过程中应禁止使用。

[1] 许喜兰，许晓君.蜂产品中药物残留的来源及其控制措施[J].养蜂科技，2004，（6）：24.

[2] 闫小峰.四环素类抗生素残留检测方法研究进展[J]中国兽药杂志，2010，44（5）：47-50.

[3] 张鑫，吴剑平，李丹妮，等.UPLC－MS/MS检测七种动物源食品中四环素类药物残留量的研究[J].中国兽药杂志，2015，49（12）：36-42.

单乃荣（1969—），女，兽医师，主要从事畜禽产品安全、兽药残留检测与研究。