竹黄颗粒介导IL-22/miR-330调控角质形成细胞增殖的机制研究

沈 慧，刘 文，姚小磊，杨志波*

（1.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005；2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011）

竹黄颗粒介导IL-22/miR-330调控角质形成细胞增殖的机制研究

沈 慧1,2，刘 文1，姚小磊2，杨志波1*

（1.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005；2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011）

目的研究竹黄颗粒干预IL-22/miR-330调控角质形成细胞增殖的分子机制。方法IL-22处理HaCaT和HKCs细胞,应用QPCR技术检测细胞中miR-330的表达变化；之后慢病毒感染HaCaT和HKCs细胞，实现miR-330的过表达和干扰，通过CCK8和BrdU技术检测细胞增殖情况；采用CCK8、Western blot、QPCR、ELISA实验分别检测不同浓度竹黄颗粒处理HaCaT、HKCs后细胞增殖能力，IL-22蛋白表达水平，miR-330表达水平及细胞分泌IL-22含量的变化。结果IL-22处理后的HaCaT和HKCs细胞中miR-330的表达水平显著下调（P＜0.01），而细胞增殖能力显著提升（P＜0.01）；过表达miR-330后 HaCaT和HKCs细胞增殖能力显著下降（P＜0.05），干扰 miR-330后 HaCaT和HKCs细胞增殖能力显著上升（P＜0.05）；竹黄颗粒处理HaCaT、HKCs后，细胞增殖能力下降（P＜0.01），IL-22蛋白表达水平显著下降（P＜0.01），miR-330表达水平显著上升（P＜0.01），细胞分泌IL-22含量显著下降（P＜0.01）。结论竹黄颗粒可以通过抑制IL-22的表达，促进miR-330的表达，从而抑制角质形成细胞增殖。

银屑病；竹黄颗粒；IL-22；miR-330；角质形成细胞

最早关于“银屑病”的记载可见于隋代巢元方所著《诸病源候论》一书[1]，明代儒医李梃在《医学入口》中首度提出癣病的发生，是由于患者素有“血分热燥”的内在病因，以至“风毒”之邪容易入侵“客于皮肤”，内外相合而致病的特点[2]。明清医籍中，对于本病病因病机的分析，诸位医家依然秉持着：内外因相互结合导致银屑病发生的观点，内因主要责之患者血分病变。

白细胞介素22（IL-22）与银屑病存在重要的关系，可以诱导角质形成细胞释放出一系列的细胞因子，如 IL-8、IL-23、IL-6、IL-21 等，炎症因子的释放可加剧炎症反应，进一步促进表皮层增殖以及棘层增厚[3]。多项研究结果表明银屑病患者的外周血血清中IL-22的表达水平与银屑病皮损区面积和病情严重程度指数呈现正相关[4-8]。Ma等[9]借助自体免疫性银屑病模型进行研究，结果发现抗IL-22的抗体可以抑制角化细胞和上皮细胞分泌炎症介质。由此可见在银屑病的发生发展过程中，存在炎症因子的不断释放及炎症反应的持续发生，而在这一过程中IL-22起着关键的促进作用，且其作用的靶点细胞是角质形成细胞。miRNA是近年来科学家发现的具有生物学调控功能的一种非编码小分子RNA。与银屑病相关的miRNAs分子中，有一些是重要的生长发育调控因子，受到广泛的关注和研究，如miR-203、miR-21、miR-146a和miR-125b等[10]。杨志波等[11]应用miRNA及基因芯片技术并结合生物信息学预测技术，成功构建了银屑病相关miRNA与靶基因及基因功能调控网络，证明特异性表达的miRNA可以通过靶向结合而调节其靶基因的表达变化，并通过靶基因的功能进一步调控银屑病的发生及发展过程。之后进一步补充和完善了前期构建的银屑病差异表达miRNA与靶基因及基因功能调控网络，预测了一批前期未研究过的miRNAs分子，miR-330就是预测的结果之一推测miR-330可能在银屑病发病机制中发挥重要功能。竹黄颗粒在临床治疗银屑病中表现出较好的疗效，且提取物可以抑制角质形成细胞的增殖。竹黄颗粒剂可以通过调节人体外周血中IL-6、TNF-a的表达水平来治疗银屑病[12]；还可以显著降低血浆和银屑病皮损组织中β-内啡肽的含量，进而抑制炎症因子的产生[13]。已证实竹黄颗粒对银屑病患者皮损组织中多个miRNAs分子具有显著调节作用，如miR-192、miR-3175、miR-194、miR-18a、miR-21、miR-629、miR-25、miR-199a-5p、miR-100、miR-99a、miR-125b、miR-409-3p、miR-99b 等[14]。

本研究将进一步验证竹黄颗粒与IL-22、miR-330之间的调控关系，以期为银屑病的治疗提供新的靶点及科学思路。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

人角质形成细胞HaCaT（HaCaT immortalized human epidermal cells）和 HKCs （human keratinocytes）细胞株均购自长沙赢润生物技术有限公司。

1.2 主要试剂

二甲基亚砜购自Sigma公司；胎牛血清购自杭州四季青生物科技公司；RPMI 1640培养液购自Hyclon公司；LV-miR-330慢病毒、LV-miR-NC慢病毒、LV-anti-miR-330慢病毒、LV-anti-NC慢病毒购自YRBIO公司，GAPDH一抗、IL-22一抗购自Abcam公司；CCK8试剂盒购自Sigma公司。

竹黄颗粒剂由湖南中医药大学第二附属医院制剂室生产，批号：20020921，规格：10 g/包，每包相当于生药含量6.25 g。主要成分为：淡竹叶、生石膏、黄芩、黄连、黄柏、栀子、漏芦、水牛角、生地黄、柴胡、白芍、当归、党参、麦冬、三七等。

1.3 细胞处理方法

1.3.1 细胞传代培养 人角质形成细胞HaCaT和HKCs分别在T25培养瓶中传代培养，细胞培养箱参数设定为37℃、5%CO2、饱和湿度。用显微镜观察细胞的生长状态，贴壁细胞生长达80%融合度时，按细胞数目1∶3的比例进行后续传代培养。

1.3.2 IL-22处理细胞 将IL-22分别溶解于无菌水中，制备成 10 mg/mL的储液，用 0.2 μm的细菌滤器在无菌环境下过滤除菌，于-20℃冻存。实验中根据每组细胞中具体的体积添加IL-22储液使培养基终浓度为100 ng/mL，对照组加相同体积的无菌水。

1.3.3 慢病毒感染细胞 将HaCaT和HKCs细胞分别传接种T25细胞瓶或96孔板中,于37℃ CO2培养箱中培养过夜,按 LV-miR-330、LV-miRNC、LV-anti-miR-330、LV-anti-NC 分组分别在各组细胞中以1×107TU滴度添加慢病毒 （按体积比1∶100 添加）。

1.3.4 竹黄颗粒处理细胞 竹黄颗粒溶解在RPMI1640培养液中，调节 pH值至 7.0，用 0.2 μm细菌滤器过滤，制备成1 g/mL的储液，于4℃保存。实验中根据每组细胞中具体的体积添加终浓度为10、20、40 mg/mL的竹黄颗粒溶液，对照组细胞中加相同体积的RPMI 1640培养液，继续培养；根据后续实验的需求，在不同时间点收集各组细胞进行相关检测。

1.4 检测实验

1.4.1 QPCR（real-time quantitative PCR）实验 经药物或其它因子处理后48 h用胰酶消化收集细胞，PBS漂洗2遍；分别提取各组细胞中的总RNA，经逆转录获得相应的cDNA，最后制备QPCR反应体系上机检测。反应程序设定为：95.0℃ 2 min；95.0 ℃ 15 s；61.0 ℃ 30 s；72.0 ℃ 20 s；然后读取数值；运行40个循环；95.0℃ 10 s；熔融曲线60.0℃至95.0℃；扩增0.5℃ 5 s；最后读取数值。根据Ct值，计算各基因相对表达量。

1.4.2 CCK8（cell couting kit-8）实验 CCK8实验主要用于检测细胞的增殖活力。将待测细胞接种于96孔细胞培养板中，24 h后向细胞培养版中添加药物或因子，继续培养，实验分组平行设置24 h、48 h和72 h三个时间点，到相应时间点向每孔细胞中加入10 μL CCK溶液，混匀后在37℃恒温培养箱中孵育4 h后，用多功能酶标仪检测各组样品在490 nm处的吸光值。

1.4.3 BrdU（5-brano-2-deoxyuridine）实验 BrdU实验主要用于检测细胞的增殖。将待测细胞接种于96孔细胞培养板中，24 h后向细胞培养板中添加药物或因子，继续培养，实验分组平行设置24 h、48 h和72 h三个时间点，到相应时间点向每孔细胞中加入20 μL BrdU标记液，继续培养6 h，再分别加入Fix Denat使DNA变性，然后加100 μL HRP标记的抗BrdU抗体，洗涤3次后加入100 μL TMB底物液显色，静置20 min后加H2SO4终止反应并振荡1 min，最后用多功能酶标仪检测各组样品在450 nm处的吸光值。

1.4.4 Western blot实验 将待测细胞接种于T25细胞培养瓶中，24 h后添加药物或因子，继续培养至 48 h，收集各组细胞并提取总蛋白进行定量分析，制备蛋白电泳样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，依次进行转膜-封闭-洗膜-杂交一抗-洗膜-杂交二抗-洗膜-显影定影。选用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为内参分析目的蛋白的相对表达水平。

1.4.5 ELISA实验 细胞处理及时间点与Western blot实验一致，48 h后收集细胞上清，2 000 r/min离心5 min除去细胞碎片，取上清用IL-22 ELISA检测试剂盒测定IL-22蛋白含量。

1.5 统计学分析

采用SPSS 18.0统计学软件对实验结果进行统计学分析。计量资料用“±s”来表示，然后用Levene法进行方差齐性检验。两个独立样本均数比较呈现正态分布的采用t检验数据，非正态分布的则采用非参数Mann-Whitney检验数据；多个独立样本均数的比较呈现正态分布的采用方差分析，非正态分布的则采用秩和检验；P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-22模拟的炎症微环境下miR-330表达水平检测

应用IL-22模拟银屑病炎症微环境后，HaCaT和HKCs细胞体外培养状态良好，细胞贴壁状态正常，分布均匀 （见图1）。QPCR检测结果如图2所示，在HaCaT细胞中，添加IL-22组相对于正常组细胞，miR-330的表达水平下调约50%，差异具有统计学意义（P＜0.01）；在 HKCs细胞中，添加 IL-22组相对于正常组细胞，miR-330的表达水平下调约70%，差异具有统计学意义（P＜0.01）。说明在炎症微环境下人角质形成细胞中miR-330的表达水平被显著抑制。

图 1 显微镜下 HaCaT（A）和 HKCs（B）细胞培养形态图（×200）

图2 IL-22模拟的炎症微环境下miR-330表达水平检测结果

2.2 miR-330过表达及干扰慢病毒感染鉴定结果

将 LV-miR-330、LV-miR-NC、LV-anti-miR-330、LV-anti-NC 4 种慢病毒按“1.3.3”中描述的步骤分别感染HaCaT和HKCs细胞。QPCR结果如图 3所示，LV-miR-330组相对于LV-NC组，HaCaT和HKCs细胞中miR-330的表达水平分别上调约22倍和16倍，差异具有统计学意义（P＜0.01）；LV-ant-miR-330组相对于LV-ant-NC组，HaCaT和HKCs细胞中miR-330的表达水平分别下调约75%和65%，差异具有统计学意义（P＜0.01）。4种慢病毒的感染结果均符合预期，可以满足后续实验要求。

图3 miR-330过表达及干扰慢病毒感染鉴定结果

2.3 IL-22模拟的炎症微环境下miR-330对角质形成细胞增殖的影响

2.3.1 CCK8实验检测IL-22及过表达/干扰miR-330对细胞增殖的影响 CCK8实验检测结果如图4和图5所示。在不加IL-22的细胞中，LV-miR-330组相对于LV-NC组，HaCaT和HKCs细胞的增殖能力均被抑制，差异具有统计学意义（P＜0.05）；在添加IL-22的细胞中，LV-miR-330组相对于LV-NC组，HaCaT和HKCs细胞的增殖能力同样被抑制，差异具有统计学意义（P＜0.01）。说明过表达miR-330可以抑制人角质形成细胞HaCaT和HKCs的增殖能力。加IL-22组细胞相对于不加IL-22组细胞，增殖能力显著提高 （P＜0.01）；在不加IL-22的细胞中，LV-ant-miR-330组相对于LV-ant-NC组，HaCaT和HKCs细胞的增殖能力均有所提高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；在添加 IL-22 的细胞中，LV-ant-miR-330组相对于LV-ant-NC组，HaCaT和HKCs细胞的增殖能力同样有所提高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。说明干扰miR-330可以促进人角质形成细胞HaCaT和HKCs的增殖；IL-22可以促进人角质形成细胞HaCaT和HKCs的增殖。

图4 IL-22及过表达miR-330对细胞增殖的影响

图5 IL-22及干扰miR-330对细胞增殖的影响

2.3.2 BrdU实验检测IL-22及miR-330对细胞增殖的影响 BrdU实验检测结果如图6所示，加IL-22组细胞相对于不加IL-22组细胞，增殖能力显著提高（P＜0.01）；LV-ant-miR-330 组相对于 LV-ant-NC组，HaCaT和HKCs细胞的增殖能力有所提高，差异具有统计学意义 （P＜0.05）；LV-miR-330组相对于LV-NC组，HaCaT和HKCs细胞的增殖均被抑制，差异具有统计学意义（P＜0.05）。说明miR-330是人角质形成细胞HaCaT和HKCs的增殖抑制因子；IL-22是人角质形成细胞HaCaT和HKCs的增殖促进因子。

图6 BrdU实验检测IL-22及miR-330对细胞增殖的影响

2.4 竹黄颗粒对角质形成细胞中IL-22/miR-330的表达变化的影响

2.4.1 竹黄颗粒对角质形成细胞增殖的影响CCK8检测结果如图7所示，加竹黄颗粒组相对于不加药组，细胞的增殖被显著抑制（P＜0.01），且随着药物浓度的递增，增殖抑制越明显。说明竹黄颗粒可以抑制人角质形成细胞HaCaT和HKCs的增殖。

图7竹黄颗粒对角质形成细胞增殖的影响

2.4.2 竹黄颗粒对角质形成细胞IL-22蛋白表达水平的影响 Western blot实验检测细胞中IL-22的蛋白表达变化，结果如图8所示，加竹黄颗粒组相对于不加药组，细胞中的IL-22蛋白表达水平显著下降（P＜0.01），且随着药物浓度的递增，下降趋势越明显。说明竹黄颗粒可以抑制人角质形成细胞HaCaT和HKCs中IL-22蛋白的表达水平。

2.4.3 竹黄颗粒对角质形成细胞IL-22分泌水平的影响 ELISA实验检测上清中炎症因子IL-22的含量，结果如图9所示，加竹黄颗粒组相对于不加药组，细胞上清中的IL-22的含量显著下降（P＜0.01），且随着药物浓度的递增，下降趋势越明显。说明竹黄颗粒可以抑制人角质形成细胞HaCaT和HKCs分泌IL-22。

2.4.4 竹黄颗粒对miR-330表达水平的影响 QPCR实验检测细胞中miR-330的表达变化，结果如图10所示，加竹黄颗粒组相对于不加药组，细胞中的miR-330表达水平显著上升（P＜0.01），且随着药物浓度的递增，上升趋势越明显。说明竹黄颗粒可以上调人角质形成细胞HaCaT和HKCs的miR-330的表达水平。

3 讨论

3.1 IL-22/miR-330与银屑病

本实验应用重组慢病毒技术在HaCaT和HKCs细胞中分别过表达和干扰miR-330的表达，结果显示过表达miR-330可以抑制人角质形成细胞HaCaT和HKCs的增殖；干扰miR-330可以促进人角质形成细胞HaCaT和HKCs的增殖。上述研究结果均证实了miR-330可以抑制病变细胞的异常增殖，在银屑病的检测与治疗中可以作为重要研发靶标。

图8竹黄颗粒对角质形成细胞IL-22蛋白表达水平的影响

图9竹黄颗粒对IL-22分泌水平的影响

图10竹黄颗粒对miR-330表达水平的影响

机体内有促炎系统和抗炎系统，其反应程度及持续时间决定组织损伤修复的结局，两者保持平衡状态，但是如果炎症反应没有得到有效控制，进一步大规模发展则很可能加重组织损伤。当前认为炎症、表皮细胞过度增殖和免疫学异常是银屑病发病机制的三个中心环节。炎症可能既是其发病的诱因，又是病情的主要症状，相互促进、相辅相成，这可能也是其病情难以根治的原因之一。本实验中，IL-22可以显著促进人角质形成细胞HaCaT和HKCs的增殖。炎症因子刺激下，人角质形成细胞表现出活跃的增殖能力，若在正常机体中，很可能有其它相应的调控基因进行干预，阻止角质细胞的异常增殖；而在银屑病患者体能，这种起关键作用的调控因子可能严重缺乏或活性丧失，导致角质细胞异常增殖，角质细胞的过量增殖会加重皮损，而皮损在缺乏控制的情况下会进一步促进炎症反应及分泌炎症因子。通过重组慢病毒技术进一步研究发现干扰miR-330的表达可以加强IL-22对角质形成细胞的增殖促进作用；过表达miR-330后可以减弱IL-22对角质形成细胞的增殖促进。这提示IL-22对角质形成细胞的调控很可能通过miR-330而实现，至于miR-330是否通过下游靶基因继续发挥调控作用则需要进一步研究。

3.2 竹黄颗粒对IL-22/miR-330的调控

银屑病中医辨证以血热型最为多见，一般认为本病多因素七情内伤或因体血热，郁久化火，火热亢盛，气郁不舒。热毒入里，伏于营血，导致血热毒盛；病程日久，则生风化燥，风燥日久，则耗伤气阴。本院欧阳恒教授主张“血热毒滞”是诱发寻常型银屑病的基本病机，并提出了“血热阴耗证”，在治疗方案中把益气养阴和清热解毒的理念融为一体，创立了竹黄颗粒。竹黄颗粒由淡竹叶、黄芩、黄柏、生石膏、栀子、黄连、水牛角、漏芦、柴胡、生地黄、白芍、党参、麦冬、当归、三七等药物组成，具有凉血活血、清热解毒、益气养阴之功效。本方切中寻常型银屑病的基本病机，以清热凉血解毒药物为主，辅以益气养阴，以防一味祛邪，耗伤正气，临床疗效甚佳。

综上，IL-22可以抑制miR-330的表达，促进角质形成细胞增殖；竹黄颗粒可以抑制IL-22的表达，促进miR-330的表达，抑制角质形成细胞增殖。

[1]隋·巢元方.诸病源候论[M].北京：人民卫生出版社，1982.

[2]明·李 梃.医学入门[M].宏道刻本，1894（清光绪二十年甲午）：卷五，外科.

[3]Huang LG,Jin X,Wu X,et al.Increased Levels of Cytokines Interleukin-17 (IL-17)and IL-22 in Deep Vein Thrombosis[J].Journal of Computational&Theoretical Nanoscience,2016,13(5):2763-2766.

[4]Lo YH,Torii K,Sai to C,et al.Serum IL-22 correlates with psoriatic severity and serum IL-6 correlates with susceptibility to phototherapy[J].Journal of Dermatologioal Science,2010,58(3):225-227.

[5]Mishra S,Kancharla H,Dogra S,et al.Comparison of the four validated psoriatic arthritis screening tools in diagnosing psoriatic arthritis in patients with psoriasis [COMPAQ Study][J].Br J Dermatol,2016.

[6]Chen C,Zhao Z,Liu Y,et al.microRNA-99a is downregulated and promotes proliferation,migration and invasion in non-small cell lung cancer A549 and H1299 cells.[J].Oncology Letters,2015,9(3):1128-1134.

[7]Michalak-Stoma A,Bartosinska J,Kowal M,et a1.Serum levels of selected Thl7 and Th22 cytokines in psoriatic patients[J].Disease Markers,2013,35(6):625-631.

[8]Shiniauchi T,Hirakawa S,Suzuki T,et al.Serum interleuk:in-22 and vascular endothelial growth factor serve as sensitive bioniarkers but not as predictorsof the rapeutic response to biolo gies in patients with psoriasis[J].J Dermatol,2013,40(10):805-812.

[9]Ma HL,Liang S,Li J,et al.IL-22 is required for Thl7 cell-mediated pathology in a mouse model of psoriasis-like skin inflammation[J].Journal of Clinical Investigation,2008,118(2):597-607.

[10]Swindell WR,Stuart PE,Starkar MK,et al.Cellular dissection of psoriasis for transcriptome analyses and the post-GWAS era[J].BMC Med Genomics,2014,7:27.

[11]杨志波,唐雪勇.银屑病差异表达microRNA与靶基因及基因功能调控网络的研究[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2012,11(2):69-73.

[12]杨志波,向亚萍,欧阳恒.银屑病患者口服竹黄颗粒剂前后血清白介素6和肿瘤坏死因子α水平的比较[J].中华皮肤科杂志,2000,33(6):423-423.

[13]杨志波,欧阳恒,谭 诚,等.竹黄颗粒剂对角质形成细胞增殖影响的实验研究[J].中国皮肤性病学杂志,2000,14(5):309-310.

[14]唐雪勇.银屑病皮损组织中miRNA的差异表达分析及竹黄颗粒剂对其的干预作用[D].长沙：湖南中医药大学,2012.

（本文编辑 苏 维）

Mechanism of Zhuhuang Granule Intervenes IL-22/miR-330 in Regulating Keratinocyte Proliferation

SHEN Hui1,2， LIU Wen1， YAO Xiaolei2， YANG Zhibo1*
（1.The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410005,China;2.Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning,Guangxi 530011,China）

ObjectiveTo study the molecular mechanism of IL-22/miR-330 intervened by Zhuhuang granule in regulating the proliferation of keratinocytes.MethodsThe expression of miR-330 in HaCaT and HKCs cells after IL-22 intervention was detected by QPCR technique.Overexpression and interference of miR-330 in HaCaT and HKCs cells were achieved by lentivirus infection,their cell proliferation was detected by CCK8 and BrdU.The cell proliferation ability,the expression of IL-22 protein,the expression level of miR-330 and the secretion of IL-22 in HaCaT and HKCs were determined by CCK8,West ern blot,QPCR and ELISA,respectively.ResultsThe expression of miR-330 in HaCaT and HKCs cells significantly decreased after treatment with IL-22 (P＜0.01),and the cell proliferation ability of HaCaT and HKCs cells was significantly improved (P＜0.01).The cell proliferation ability of HaCaT and HKCs cells significantly decreased after miR-330 overexpression (P＜0.05).After interference of miR-330 expression,cell proliferation ability of HaCaT and HKCs had a significant increase (P＜0.05).Cell proliferation ability of HaCaT and HKCs treated by different concentrations of Zhuhuang granule decreased (P＜0.01).The expression of IL-22 protein decreased significantly(P＜0.01),the expression level of miR-330 increased significantly(P＜0.01),and the content of IL-22 decreased significantly (P＜0.01).Conclusion Zhuhuang granule could inhibit the expression of IL-22,promote the expression of miR-330 and inhibit the proliferation of keratinocytes.

psoriasis;Zhuhuang granule;IL-22;miR-330;keratinocytes

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.07.004

2017-05-11

国家自然科学基金面上资助项目（81573985）。

沈 慧，女，博士，主治医师，主要从事中西医结合防治银屑病的研究。

*杨志波，男，教授，主任医师，博士研究生导师，E-mail：dr.yang888@126.com。

本文引用：沈 慧，刘 文，姚小磊，杨志波.竹黄颗粒介导IL-22/miR-330调控角质形成细胞增殖的机制研究[J].湖南中医药大学学报，2017，37（7）：708-714.