舒胃汤对功能性消化不良大鼠胃肠平滑肌Bcl-2、Caspase-12表达的影响

姜苏南，郭 璇，徐 寅，王小娟*，郭建生*，黄琳桂，谭华梁，肖 麟，阳松威

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

舒胃汤对功能性消化不良大鼠胃肠平滑肌Bcl-2、Caspase-12表达的影响

姜苏南1，郭 璇1，徐 寅2，王小娟2*，郭建生1*，黄琳桂1，谭华梁2，肖 麟2，阳松威1

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

目的通过观察舒胃汤对功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）肝郁脾虚证模型大鼠胃窦和幽门区Bcl-2、Caspase-12蛋白及mRNA表达的影响，探讨舒胃汤治疗FD的作用和机制。方法将Wistar大鼠60只随机分成空白组，模型组，莫沙必利组，舒胃汤低、中、高剂量组。按改良复合病因造模法造成FD肝郁脾虚证模型，连续21 d。分组干预，连续14d。处死大鼠后，取胃窦平滑肌和十二指肠上段组织。Western-blot法检测Bcl-2、Caspase-12蛋白表达；RT-PCR法检测Bcl-2、Caspase-12的mRNA表达。结果Western-blot检测发现，与空白组比，模型组Caspase-12表达升高而Bcl-2表达降低（P＜0.05）；与模型组比，舒胃汤中、高组Caspase-12 mRNA表达显著降低（P＜0.01）。RT-PCR检测发现，与空白组比，模型组Caspase-12表达显著升高而Bcl-2表达显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，舒胃汤低、中、高剂量组Caspase-12表达显著降低（P＜0.01），中、高剂量组Bcl-2表达显著升高（P＜0.01）。结论舒胃汤可能通过调控胃窦和幽门区凋亡因子Bcl-2、Caspase-12的表达抑制平滑肌细胞的凋亡，从而有效地治疗功能性消化不良。

舒胃汤；功能性消化不良；Bcl-2；Caspase-12；细胞凋亡；柴胡；香附

功能性消化不良 （functional dyspepsia,FD）为临床常见疾病[1]，但就目前而言西方医学理论对于FD的发病机制和病因还未完全确定，且有关FD的治疗仍滞留在对症处理阶段[2]，虽也有一定的疗效，但长期服用西药出现的副作用较多[3]。通过运用中医药理论来进一步明确FD的发病机制并探寻安全有效的防治方法已成为临床消化治疗领域研究探索的热点内容。舒胃汤由王小娟教授根据其多年治疗功能性消化不良的临床经验将逍遥散化裁而来，临床治疗取得了较好的疗效[4-5]。本实验从胃肠平滑肌细胞中Bcl-2、Caspase-12蛋白和mRNA表达的变化，初步探讨舒胃汤治疗FD的作用与机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

Wistar大鼠60只，SPF级，雌雄各半，体质量180～200 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司购入，许可证号：SYXK（湘）2013-0005。饲养于室温20～25℃，湿度40%～45%的环境，自然光照时间12 h。按体质量和分层随机法分组设计，将其分为6组：空白组，模型组，莫沙必利组，舒胃汤低、中、高剂量组，每组10只。

1.2 药物与试剂

舒胃汤由柴胡10 g，枳实 9 g，香附 8 g，白术15 g，白芍 10 g，延胡索 8 g，旋覆花 8 g，川楝子6 g，焦神曲10 g组成，饮片由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供；枸橼酸莫沙必利片，鲁南贝特制药有限公司提供，批号：25140608；Tween-20、APS、 甘氨酸 （均由美国 Sigma提供），Protein phosphatase抑制剂（瑞士罗氏公司），逆转录试剂盒（立陶宛Fermentas公司），引物 （南京金斯瑞公司），HRP goat anti-mouse、anti-rabbit IgG （美国 Proteintech）等。

1.3 仪器

TS-92型摇床、QL-901型旋涡混合器 （江苏海门其林贝尔公司）；164-5050型电泳仪 （美国Biorad公司）；DYCZ-24EN型电泳槽、DYCZ-40A型转膜仪 （北京六一生物科技有限公司）；PIKO REAL 96型荧光定量RCP仪（美国Thermo公司）等。

2 方法

2.1 药物制备

参照文献[6]大鼠与人临床用药剂量体型系数公式换算得出，用于灌胃的舒胃汤高、中、低剂量为30.68、15.34、7.67g/kg，分别相当于人临床用量 4 倍、2倍、1倍。舒胃汤饮片水煎至3.068 g/mL，密封保存。莫沙必利的剂量为1.37 mg/kg，相当于人临床用量的1倍。实验时用蒸馏水稀释为0.137 mg/mL溶液。

2.2 动物造模

除空白组大鼠外，其余5组按改良复合病因造模法[7]（慢性束缚应激+饮食失节+过度疲劳+夹尾激怒）造成FD肝郁脾虚证模型。先将大鼠束缚3 h，再于（22±1）℃的水中游泳10 min，隔日给食，并于禁食日进行夹尾激怒0.5 h，连续21 d。

2.3 干预及样本处理

第22天起每天进行舒胃汤低、中、高剂量和莫沙必利组的相应药液灌胃，空白组和模型组则用蒸馏水灌胃（10 mL/kg），每天 1次，连续 14 d。末次给药2 h后，麻醉处死大鼠，开腹，结扎胃贲门和胃幽门，迅速取出距幽门0.5 cm胃窦壁全层以及距幽门2 cm的十二指肠上段组织，-80℃冰箱存放备用。

2.4 指标检测

2.4.1 Western-blot法检测FD肝郁脾虚证大鼠胃窦和十二指肠bcl-2、Caspase-12蛋白表达 将所取胃肠组织磨碎吹匀，冰上裂解，冷冻离心取上清液；SDS-PAGE 电泳；Bcl-2 转膜 30 min，Caspase-12、actin转膜60 min；配好1×TBST中室温密封1 h；一抗（Bcl-2 1:100、Caspase-12 1∶500、actin 1∶4 000）恒温孵育过夜；二抗（1∶3 000）恒温孵育 1 h；Triton 溶液漂洗，ECL发光液显色，以X胶片显影曝光处理。

2.4.2 RT-PCR法检测FD肝郁脾虚证大鼠胃窦和十二指肠bcl-2、Caspase-12 mRNA表达 取一定量的细胞样品，加入Trizol溶液提取总RNA。将所取胃肠组织总mRNA逆转录成cDNA，按说明书具体的步骤进行操作。30 μL反应体系配制：5×RT Buffer 6 μL，Primer Mix 3 μL，RNase-Free Wate 4.5 μL，dNTP Mix,2.5mM Each6 μL，RNA Template 6 μL，HiFiScript,200 U/μL 1.5 μL，DTT,0.1 M 3 μL。 扩 增 条 件 ：42 ℃，60 min；85 ℃，10 min；所得cDNA置于-80℃冰箱保存。取微量的RNA进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶图像成像分析系统观察处理。

引物序列设计为：Bcl-2-F：5'-ATTGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3'；Bcl-2-R：5'-CCTACCCAGC CTCCGTTATCC-3'（152 bp）；Caspase-12-F：5'-TCCTGGTCTTTATGTCCC-3'；Caspase-12-R：5'-CAGTATGTCTGCCTCTGC-3' （180 bp）；β-actin-F：5'-CATC CTGCGTCTGGACCTGG-3'；β-actin-R：5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'（107 bp）。

2.5 统计学处理

所有实验数据以Excel录入处理，运用SPSS 19.0统计软件进行分析，组间计量资料对比先作正态性和方差齐性的检验，满足方差齐性，采用One-way ANOVA法进行方差分析；若不满足方差齐性，则采用非参数法进行检验。 数据用“±s”表示，P＜0.05 即差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

3 结果

3.1 Western-blot检测各组大鼠胃窦和幽门区Caspase-12、Bcl-2蛋白表达水平比较

与空白组相比，模型组大鼠胃窦和幽门区平滑肌中Caspase-12表达量有较明显升高而Bcl-2表达量降低（P＜0.05）。与模型组相比，舒胃汤中、高剂量组大鼠Caspase-12表达量显著降低（P＜0.01）。结果见表1和图1。

表1各组大鼠胃窦和幽门区Caspase-12、Bcl-2蛋白表达水平比较 （±s，n=10）

表1各组大鼠胃窦和幽门区Caspase-12、Bcl-2蛋白表达水平比较 （±s，n=10）

注：与空白组相比，*P＜0.05；与模型组相比，＃＃P＜0.01。

组别空白组模型组莫沙必利组舒胃汤低剂量组舒胃汤中剂量组舒胃汤高剂量组剂量/（g/kg）--0.00137 7.67 15.34 30.68 F P--Caspase-12/GAPDH 0.441±0.096 0.549±0.053*0.493±0.080 0.460±0.100 0.411±0.113＃＃0.383±0.084＃＃4.828 0.001 Bcl-2/GAPDH 0.559±0.138 0.386±0.166*0.416±0.132 0.411±0.127 0.431±0.141 0.500±0.146 2.221 0.065

图1各组大鼠胃窦和幽门区Caspase-12、Bcl-2蛋白表达电泳图

3.2 RT-PCR检测各组大鼠胃窦和幽门区Caspase-12、Bcl-2 mRNA表达水平比较

与空白组相比，模型组大鼠胃窦和幽门区平滑肌中Caspase-12表达量显著升高而Bcl-2表达量显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，舒胃汤低、中、高剂量组大鼠Caspase-12表达量显著降低（P＜0.01），中、高剂量组Bcl-2表达量显著升高（P＜0.01）。结果见表2。

表2各组大鼠胃窦和幽门区Caspase-12、Bcl-2 mRNA相对表达量比较 （±s，n=10）

表2各组大鼠胃窦和幽门区Caspase-12、Bcl-2 mRNA相对表达量比较 （±s，n=10）

注：与空白组相比，**P＜0.01；与模型组相比，＃＃P＜0.01。

组别空白组模型组莫沙必利组舒胃汤低剂量组舒胃汤中剂量组舒胃汤高剂量组剂量/（g/kg）--0.00137 7.67 15.34 30.68 F P--Caspase-12 mRNA 0.844±0.345 4.719±1.319**2.270±0.551＃＃3.675±0.567＃＃1.653±0.168＃＃1.139±0.425＃＃48.04 0.000 Bcl-2 mRNA 8.319±0.814 1.140±0.410**5.413±1.103＃＃1.697±0.611 5.133±1.293＃＃6.173±1.777＃＃58.49 0.000

4 讨论

目前中医学理论对FD的辨证分型虽还尚未统一，但究其病机病因，古今医家均各有论述，形成了脾胃气机升降失调是FD基本病机且为病理关键的共识。因此疏肝健脾法为治疗FD的根本，舒胃汤方中，柴胡辛行苦泄，香附疏肝理气，二者疏肝解郁、条达肝气共为君药，以疏木郁之不达补土虚之不运。延胡索理气解郁，行气止痛；白术甘温健脾，益气补虚；白芍养血柔肝，令肝气条达无犯土虚；枳实苦降辛散，破气消痞；诸药合用共为臣药。旋覆花行气降气，有较好的降逆止呕作用，善治噫气、呕吐诸症；川楝子舒肝，行气止痛；焦神曲消积化滞共为佐使药。全方运用扶土抑木之法，使肝郁得解，脾弱得健，则FD肝郁脾虚诸症可愈。

细胞的凋亡是真核细胞在凋亡刺激信号的作用下，启动细胞死亡机制，经过信号的转导，从而致使细胞程序性变异和死亡的过程。又被称为Ⅰ型程序性细胞死亡，受多种相关基因的调控，如Caspase-12、Bcl-2等。Caspase-12是内质网应激（过度）介导细胞凋亡的途径之一。目前仅在大鼠、小鼠体内取得，人体内因基因突变而失去了调控凋亡的活性，但其异构体Caspase4被认为与之有相类似的作用而受到了广泛的关注。Caspase-12被激活后进入细胞液，通过激活其他Caspase家族的因子来完成凋亡，提示可将Caspase-12作为靶点来为Caspase-4的研究提供实验基础。Bcl-2是在细胞凋亡的研究中最受重视的癌基因之一，是一种抗凋亡因子，其确切的作用机制尚未阐明，一般认为其通过线粒体、细胞内Ca2+等多种途径的共同调节，可起到抑制细胞凋亡的作用。

通过前期的相关基础与临床研究[8-11]发现，FD发病机制复杂多变，而又尚未十分明确，但其主要病理生理基础是胃肠动力学障碍[12]，胃肠动力障碍的形成牵涉到不同器官间功能的失调，多种细胞的信号传导受阻碍，胃肠平滑肌收缩功能失调以及相关基因、蛋白表达的不足等，而这些也可能会诱发细胞的凋亡。本实验通过检测对比发现，舒胃汤对于造成FD肝郁脾虚证模型大鼠的胃窦和十二指肠肌条细胞中的Caspase-12、Bcl-2的蛋白和mRNA表达有明显影响，尤其对于其mRNA表达进行对比分析可发现，通过舒胃汤对模型大鼠的干预，能显著降低Caspase-12和升高Bcl-2表达（P＜0.01）。 即提示功能性消化不良可能与抑制胃窦和十二指肠组织平滑肌细胞凋亡有关，会受到相关凋亡因子表达的影响。因此，可认为舒胃汤可能通过抑制胃肠道起搏细胞的凋亡，促进胃肠动力的恢复，而有效治疗FD，但其具体的改善和调节机制还需进一步的研究与讨论。

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（本文编辑 杨 瑛）

Effects of Shuwei Decoction on the Expression of Bcl-2,Caspase-12 in Gastrointestinal Smooth Muscle Rats with Functional Dyspepsia

JIANG Sunan1,GUO Xuan1,XU Yin2,WANG Xiaojuan2*,GUO Jiansheng1*,HUANG Lingui1,TAN Hualiang2,XIAO Lin2,YANG Songwei1
(1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha,Hunan 410208,China;2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

ObjectiveTo observe the effect of Shuwei decoction on the expression of Bcl-2,Caspase-12 protein and mRNA in gastric antrum and pylorus of FD (functional dyspepsia)model rats with liver-stagnation and spleen-deficiency syndrome,and to explore the effect and mechanism of Shuwei decoction on FD.MethodsThe 60 Wistar rats were randomly divided into blank group,model group,mosapride group,Shuwei decoction low,medium and high dose groups.FD syndrome of liver stagnation and spleen deficiency was established by the method of improved complex etiology,21 continuous days.Each group of rats were fed with the corresponding liquid 10 mL/kg,14 continuous days.After the rats were sacrificed,the gastric antrum smooth muscle and the duodenum were selected.Western-blot method was used to detect the expression of Bcl-2 and Caspase-12 protein.The Bcl-2 and Caspase-12 mRNA expression were detected by RT-PCR assay.ResultsWestern-blot detection showed that compared with the blank group,the expression of Caspase-12 in model group increased and the expression of Bcl-2 decreased (P＜0.05).Compared with the model group,the expression of Caspase-12 mRNA significantly decreased in the middle and high levels of the decoction (P＜0.01).RT-PCR shows that compared with model group,Caspase-12 expression increased and Bcl-2 expression decreased significantly in the model group(P＜0.01).Compared with the model group,the expression of Caspase-12 in Shuwei decoction low,medium and high dose groups significantly decreased(P＜0.01),the expression of Bcl-2 in middle and high dose groups significantly increased(P＜0.01).ConclusionShuwei decoction could inhibit the apoptosis of smooth muscle cells by regulating the expression of Bcl-2 and Caspase-12 in gastric antrum and pylorus,so as to effectively treat functional dyspepsia.

Shuwei decoction;functional dyspepsia;Bcl-2;Caspase-12;cell apoptosis;radix bupleuri;rhizoma cyperi

R285.5；R57

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.07.003

本文引用：姜苏南，郭 璇，徐 寅，王小娟，郭建生，黄琳桂，谭华梁，肖 麟，阳松威.舒胃汤对功能性消化不良大鼠胃肠平滑肌Bcl-2、Caspase-12表达的影响[J].湖南中医药大学学报，2017，37（7）：704-707.

2017-04-28

国家自然科学基金项目（81373577）；国家自然科学基金青年项目（81403384）；湖南省教育厅优秀项目（15B151）。

姜苏南，女，在读硕士研究生，研究方向：中药新药研究与开发。

*王小娟，女，主任医师，硕士研究生导师，E-mail:1047610399@qq.com；*郭建生，博士研究生导师，硕士学位，E-mail:gjs7878@126.com。