青海地区不同海拔藏汉民族子痫前期患者人类白细胞抗原G表达研究

谢莹莺，赵海宁，裴青青，曲新霞，张振平，赵得雄

·论著·

青海地区不同海拔藏汉民族子痫前期患者人类白细胞抗原G表达研究

谢莹莺1*，赵海宁1，裴青青1，曲新霞1，张振平1，赵得雄2

目的 探讨青海地区不同海拔藏汉民族子痫前期患者的人类白细胞抗原G(HLA-G)表达情况。方法 选取2015年1月—2016年1月在青海大学附属医院分娩的汉族产妇30例(海拔2 200 m)，其中子痫前期16例，正常妊娠14例；另选取同期在玉树藏族自治州人民医院分娩的藏族产妇21例(海拔3 700 m)，其中子痫前期10例，正常妊娠11例。采用实时定量聚合酶链式反应法和蛋白质印迹法检测不同情况产妇胎盘组织中的HLA-G mRNA和蛋白表达。结果 不同情况产妇HLA-G mRNA和蛋白表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)。低海拔汉族子痫前期、高海拔藏族正常妊娠、高海拔藏族子痫前期产妇HLA-G mRNA和蛋白表达低于低海拔汉族正常妊娠产妇，差异有统计学意义(P<0.05)；高海拔藏族子痫前期产妇HLA-G mRNA和蛋白表达低于高海拔藏族正常妊娠产妇，差异有统计学意义(P<0.05)；高海拔藏族子痫前期产妇HLA-G蛋白表达低于低海拔汉族子痫前期产妇，差异有统计学意义(P<0.05)。而低海拔汉族子痫前期产妇与高海拔藏族正常妊娠产妇HLA-G mRNA和蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)；低海拔汉族子痫前期产妇与高海拔藏族子痫前期产妇HLA-G mRNA表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 高原慢性低氧环境可能影响HLA-G基因的表达，不同海拔藏汉民族HLA-G的差异性表达可能在青海高原地区子痫前期的发病过程中起重要作用，是导致高原地区子痫前期发病率高的原因之一。

先兆子痫；HLA抗原；高海拔；藏族；汉族

谢莹莺，赵海宁，裴青青，等.青海地区不同海拔藏汉民族子痫前期患者人类白细胞抗原G表达研究[J].中国全科医学，2017，20(16)：1978-1982.[www.chinagp.net]

XIE Y Y,ZHAO H N,PEI Q Q,et al.Expression of human leucocyte antigen G in Tibetan and Han patients with preeclampsia at different altitudes of Qinghai Area[J].Chinese General Practice，2017，20(16)：1978-1982.

子痫前期是妊娠期特有疾病，严重影响母婴健康。在我国，妊娠期高血压的发病率为5%～12%[1]133，青海地区的子痫前期发病率为12%～15%，高原地区子痫前期发病率高于平原地区，且子痫前期发病率随海拔的升高呈明显上升趋势[2]。人类白细胞抗原G(HLA-G)是一种可受应激诱导的蛋白质分子，高原慢性低氧环境可能会影响HLA-G基因的表达，是导致高海拔地区子痫前期发病率较高的原因之一[3]。本研究采用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(western blotting)法检测HLA-G mRNA和蛋白的表达，并探讨不同海拔藏汉民族的HLA-G表达差异及其与子痫前期发病的关系，从而为高原低氧条件下导致HLA-G表达降低的假说提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2015年1月—2016年1月在青海大学附属医院分娩的汉族产妇30例(海拔2 200 m)，其中子痫前期16例，正常妊娠14例；另选取同期在玉树藏族自治州人民医院分娩的藏族产妇21例(海拔3 700 m)，其中子痫前期10例，正常妊娠11例。子痫前期的诊断标准参照《妇产科学》(8版)[1]114-116。纳入标准：(1)世居西宁市/玉树藏族自治州的原著居民；(2)分娩方式为剖宫产；(3)正常妊娠妇女，无高血压、蛋白尿症状，无急、慢性传染性疾病，无不良孕产史；(4)子痫前期患者妊娠20周后，出现收缩压≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和/或舒张压≥90 mm Hg，伴蛋白尿≥0.3 g/h或随机尿蛋白(+)。排除标准：(1)伴原发和继发性高血压者；(2)合并内、外科疾病者；(3)多胎妊娠者。本研究通过了青海大学附属医院伦理委员会的批准，纳入产妇均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料收集 由经过统一培训的研究生通过医院医疗护理系统记录纳入产妇的一般资料，包括年龄、孕周、体质量、收缩压、舒张压、孕产史等。

1.2.2 HLA-G表达检测

1.2.2.1 标本采集 剖宫产术中取新鲜胎盘组织，于胎盘母体面中央剪取约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm组织数块，经0.9%氯化钠溶液处理后置于无菌离心(EP)管中，-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2.2 mRNA表达检测 采用RT-PCR法，以人β-肌动蛋白(β-actin)为内参照基因。胎盘总RNA提取按RnaExTM Total RNA Isolation Solution (GENEray，GK3006)说明书进行，总RNA采用Rayscript cDNA Synthesis KIT(GENEray，GK8030)进行反转录合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)。cDNA序列和β-actin序列由Invitrogen公司设计并合成，引物序列见表1。SYBR Green Mix和引物混合物配置为Mix 10.0 μl+引物1.0 μl，采用SYBR Green 10 μl体系(cDNA模板5.0 μl、Mix+引物5.0 μl)，在ABI 7500 Real Time PCR仪上进行聚合酶链式反应(PCR)反应。条件为95 ℃预变性：10 min，1个循环；变性：95 ℃ 10 s，退火延伸：60 ℃ 34 s，40个循环；溶解曲线采集：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，1个循环。反应结束后，生成荧光反应曲线，以PCR循环数阈值(cycle threshold，Ct)表示HLA-G的mRNA表达水平，基因的相对表达水平为2-ΔΔCt。

表1 RT-PCR引物序列

注：RT-PCR=实时定量聚合酶链式反应，HLA-G=人类白细胞抗原G，β-actin=β-肌动蛋白

1.2.2.3 蛋白表达检测 采用western blotting法。取胎盘组织约100 mg，加入1 ml TPEB9〔使用前需加入苯甲基磺酰氟(PMSF)〕提取组织蛋白，采用BCA蛋白定量试剂对蛋白质进行定量，蛋白质变性后上样30 g，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，胶浓度为12.5%，电泳条件为200 V、45 min，转膜条件为200 mA，2 h，采用5%脱脂奶粉(TBST配制)于室温下封闭2 h。加入一抗(MEM-G/1小鼠抗人单克隆抗体，美国abcam公司)1∶200稀释，室温下孵育2 h；1∶2 000稀释的二抗〔辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体，中杉金桥〕，室温孵育1 h。以β-actin为内参照(Mouse β-actin抗体稀释比例为1∶5 000)，使用EasySee Western Blot Kit发光液孵育1 min，柯达医用胶片曝光显影。

2 结果

2.1 不同情况产妇一般资料比较 不同情况产妇年龄、孕周、体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；收缩压、舒张压比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.2 不同情况产妇HLA-G mRNA和蛋白表达比较 不同情况产妇HLA-G mRNA和蛋白表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

(1)mRNA：低海拔汉族子痫前期、高海拔藏族正常妊娠、高海拔藏族子痫前期产妇与低海拔汉族正常妊娠产妇HLA-G mRNA表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)；高海拔藏族子痫前期产妇与高海拔藏族正常妊娠产妇HLA-G mRNA表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)；而低海拔汉族子痫前期产妇与高海拔藏族正常妊娠、高海拔藏族子痫前期产妇HLA-G mRNA表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

(2)蛋白：低海拔汉族子痫前期、高海拔藏族正常妊娠、高海拔藏族子痫前期产妇与低海拔汉族正常妊娠产妇HLA-G蛋白表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)；高海拔藏族子痫前期产妇与低海拔汉族子痫前期、高海拔藏族正常妊娠产妇HLA-G蛋白表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)；而低海拔汉族子痫前期产妇与高海拔藏族正常妊娠产妇HLA-G蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表3、图1)。

表2 不同情况产妇一般资料比较

注：与低海拔汉族正常妊娠比较，aP<0.05；与低海拔汉族子痫前期比较，bP<0.05；与高海拔藏族正常妊娠比较，cP<0.05；1 mm Hg=0.133 kPa

表3 不同情况产妇HLA-G mRNA和蛋白表达比较〔M(QR)〕

Table 3 Comparison of the expression of HLA-G mRNA and protein among subjects in different conditions

一般情况例数mRNA蛋白低海拔汉族正常妊娠141.01(0.41)96.28(9.76)低海拔汉族子痫前期160.47(0.17)a70.84(29.81)a高海拔藏族正常妊娠110.72(0.19)a82.41(4.67)a高海拔藏族子痫前期100.30(0.16)ac10.91(3.41)abcF值17.6048.59P值<0.001<0.001

注：与低海拔汉族正常妊娠比较，aP<0.05；与低海拔汉族子痫前期比较，bP<0.05；与高海拔藏族正常妊娠比较，cP<0.05

注：HLA-G=人类白细胞抗原G，β-actin=β-肌动蛋白

图1 不同情况产妇胎盘组织中HLA-G蛋白表达

Figure 1 Expression of HLA-G protein in placenta among subjects in different conditions

3 讨论

3.1 高原地区子痫前期的发病情况 青海地处青藏高原，其中玉树藏族自治州等广大牧区位于青南青藏高原腹地的三江源头，自然条件严酷。自2010年“玉树 4.14 地震”后，本科医生轮流常年驻守玉树藏族自治州医院妇产科，发现当地育龄期妇女饱受妊娠期高血压的困扰，严重影响了母婴健康。低氧是导致妊娠期高血压高发的原因之一，现有研究结果表明高原地区妊娠期高血压较平原地区高发[2]。青海高原地区的发病率为12%～15%，与国外报道的高海拔地区孕妇发展为妊娠期高血压风险升高3～4倍的结果基本吻合[4]。吴翠群[5]对迪庆高原地区妊娠期高血压的发病情况进行了调查，发现随着海拔的升高，子痫前期发病趋势明显上升，尤其是3 000 m以上的高海拔地区发病率明显高于3 000 m以下地区。张军等[6]对西藏不同海拔地区妊娠期高血压的调查发现，汉族孕产妇妊娠期高血压的发病率高于世居藏族孕产妇，但随着居住地区海拔的升高，无论藏族还是汉族孕产妇的妊娠期高血压发病率均升高。BROWNE等[7]的研究发现，在高海拔地区妊娠时低体质量儿、小于孕龄儿及子痫前期的发病率均增加，可能归因于胎盘组织低氧和子宫胎盘供血量降低，高海拔低氧环境影响胎盘邻近子宫动脉和末梢子宫小动脉的循环。目前为止，子痫前期的发病原因不详，尤其在高海拔地区子痫前期发病率高的原因有待进一步研究。

3.2 HLA-G与子痫前期的关系 近年来关于子痫前期易感基因的研究颇多，而HLA-G是一种人类主要组织相容性复合物(MHC)抗原，与妊娠关系密切[8]，具有有限的基因多态性、限制性组织分布、特殊的选择性剪切模式等特征[9]。同时，HLA-G参与了胎盘细胞滋养细胞侵入子宫螺旋动脉的过程，使胎儿免受母体免疫细胞的攻击[10]。以上特点和功能决定了其在维持母胎免疫耐受方面的作用以及和生殖免疫功能的密切相关性。赵三存等[11]在孕妇外周血、胎盘组织及脐血中的研究发现，HLA-G在子痫前期呈明显低表达，HLA-G水平降低可能与子痫前期的发病机制有关。ZHU等[12]通过对正常妊娠和重度子痫前期产妇的胎盘组织中 HLA-G mRNA和蛋白进行定量检测，发现子痫前期产妇胎盘组织中HLA-G mRNA和蛋白表达明显降低，HLA-G 的表达异常可能与子痫前期发病有关。本课题组在青海高原地区的前期研究结果表示，子痫前期患者血清和胎盘组织中的HLA-G表达均低于正常产妇，HLA-G可能参与了高原地区子痫前期的发生，且与病情严重程度有关；但因试剂、实验方法等因素的影响，与平原地区的差异无法做出精确对比[3]。关于高海拔地区子痫前期发病率的临床研究较多，但关于高度低氧环境下发病机制的研究较少，故研究高原低氧环境下妊娠期高血压发病率高的原因显得尤为紧迫和重要。

3.3 本研究意义及进一步计划 HLA-G与子痫前期的相关性是近年国内外较为关注的课题，本课题组在前期研究的基础上，采用RT-PCR法和western-blotting法首次检测了青海地区子痫前期患者在不同海拔高度下胎盘组织及血清中HLA-G mRNA和蛋白的表达差异，试图从分子和免疫水平论证随着海拔的升高和低氧环境的不断扩大，子痫前期的发病率增加的原因。结果表明，在海拔3 700 m的玉树地区藏族子痫前期产妇HLA-G mRNA和蛋白表达低于同地区藏族正常妊娠产妇；在海拔2 200 m的西宁地区汉族子痫前期产妇HLA-G蛋白表达低于同地区汉族正常妊娠产妇；同时海拔3 700 m藏族正常妊娠产妇HLA-G mRNA和蛋白表达也低于海拔2 200 m汉族正常妊娠产妇；海拔3 700 m藏族子痫前期产妇HLA-G蛋白表达亦低于海拔2 200 m汉族子痫前期产妇；但海拔2 200 m汉族子痫前期产妇与海拔3 700 m藏族正常妊娠产妇的HLA-G mRNA和蛋白表达间无差异，可能由低氧环境对HLA-G的影响所致。综上所述，高原慢性低氧环境可能影响HLA-G基因的表达，是导致高海拔地区子痫前期发病高的原因之一，并且随着海拔高度的增加HLA-G的表达水平呈下降趋势。本课题组下一步计划研究在青海地区，藏汉民族间HLA-G基因型的差异性与子痫前期易感性和疾病发展间的相关性。从而从民族基因多态性角度，阐述青海地区子痫前期患病率高的可能原因，并为疾病的预测和基因治疗提供重要线索。

作者贡献：谢莹莺进行文章的构思与设计、研究的实施与可行性分析、结果的分析与解释，撰写论文，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理；赵海宁、赵得雄进行数据收集；裴青青进行数据整理；曲新霞进行论文的中英文修订；张振平进行统计学处理。

本文无利益冲突。

[1]谢幸，苟文丽.妇产科学[M].8版.北京：人民卫生出版社，2013. XIE X,GOU W L.Obstetrics and gynecology[M].8th ed.Beijing:People′s Medical Publishing House,2013.

[2]谢莹莺，李凤莲，赵生珠，等.青海地区子痫前期患者血清可溶性人类白细胞相关抗原G检测及预诊指标的建立[J].青海医学院学报，2013，34(2)：133-136.DOI：10.3969/j.issn.1006-8252.2013.02.014. XIE Y Y,LI F L,ZHAO S Z,et al.The detection of sHLA-G in preeclampsia to establish preliminary examination index at Qinghai plateau[J].Journal of Qinghai Medical College,2013,34(2):133-136.DOI:10.3969/j.issn.1006-8252.2013.02.014.

[3]谢莹莺，李凤莲，杨娟，等.青海高原地区子痫前期患者HLA-G蛋白表达研究[J].中国妇幼保健，2015，30(27)：4709-4711.DOI：10.7620/zgfybj.j.issn.1001-4411.2015.27.51. XIE Y Y,LI F L,YANG J,et al.Study on the expression of HLA-G protein of preeclampsia patients in Qinghai[J].Maternal and Child Health Care of China,2015,30(27):4709-4711.DOI:10.7620/zgfybj.j.issn.1001-4411.2015.27.51.

[4]TAL R.The role of hypoxia and hypoxia-inducible factor 1 alpha in preeclampsia pathogenesis[J].Biol Reprod,2012,87(6):134.

[5]吴翠群.迪庆高原地区妊娠期高血压疾病的发病情况调查与分析[J].昆明医学院学报，2010，31(2)：104-106.DOI：10.3969/j.issn.1003-4706.2010.02.028. WU C Q.The prevalence of pregnancy-induced hypertension in Diqing plateau[J].Journal of Kunming Medical University,2010,31(2):104-106.DOI:10.3969/j.issn.1003-4706.2010.02.028.

[6]张军，国吉.西藏不同海拔地区妊娠期高血压疾病的调查分析[J].中国计划生育学杂志，2007，15(9)：548-550.DOI：10.3969/j.issn.1004-8189.2007.09.018. ZHANG J,GUO J.Investigation and analysis of hypertensive disorder complicating pregnancy at different altitudes in Tibet[J].Chinese Journal of Family Planning,2007,15(9):548-550.DOI:10.3969/j.issn.1004-8189.2007.09.018.

[7]BROWNE V A,TOLEDO-JALDIN L,DAVILA R D,et al.High-endarteriolar resistance limits uterine artery blood flow and restricts fetal growth in preeclampsia and gestational hypertension at high altitude[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2011,300(5):R1221-1229.DOI:10.1152/ajpregu.91046.2008.

[8]HVIID T V.Non Classical human leukocyte antigen(HLA) tissue types from implantation to transplantation[J].Ugeskr Laeger,2006,168(5):461-466.

[9]DAHL M,DJURISIC S,HVIID T V.The many faces of human leukocyte antigen-G:relevance to the fate of pregnancy[J].J Immunol Res,2014：591489.DOI:10.1155/2014/591489.

[10]GONZALEZ A,REBMANN V,LEMAOULT J,et al.The immunosuppressive molecule HLA-G and its clinical implications[J].Crit Rev Clin Lab Sci,2012,49(3):63-84.DOI:10.3109/10408363.2012.677947.

[11]赵三存，李志斌，贺同强，等.人类白细胞抗原G的表达与子痫前期发病的关系[J].中华妇产科杂志，2011，46(10)：758-762.DOI：10.3760/cma.j.issn.0529-567x.2011.10.009. ZHAO S C,LI Z B,HE T Q,et al.The relationship between the expression of human leukocyte antigen G and preeclampsia[J].Chinese Journal of Obstetrics and Gynecology,2011,46(10):758-762.DOI:10.3760/cma.j.issn.0529-567x.2011.10.009.

[12]ZHU X,HAN T,YIN G,et al.Expression of human leukocyte antigen-G during normal placentation and in preeclamptic pregnancies[J].Hypertens Pregnancy,2012,31(2):252-260.DOI:10.3109/10641955.2011.638955.

(本文编辑：王凤微)

Expression of Human Leucocyte Antigen G in Tibetan and Han Patients with Preeclampsia at Different Altitudes of Qinghai Area

XIEYing-ying1*,ZHAOHai-ning1,PEIQing-qing1,QUXin-xia1,ZHANGZhen-ping1,ZHAODe-xiong2

1.DepartmentofObstetrics,AffiliatedHospitalofQinghaiUniversity,Xining810001,China2.DepartmentofObstetrics,QinghaiRedCrossHospital,Xining810000,China*Correspondingauthor:XIEYing-ying,Chiefphysician,Mastersupervisor;E-mail:xyy09001@163.com

Objective To investigate the expression of human leucocyte antigen G(HLA-G) in Tibetan and Han patients with preeclampsia at different altitudes of Qinghai Area.Methods 30 Han puerperas delivered in Affiliated Hospital of Qinghai University(an altitude of 2 200 m) from January 2015 to January 2016 were selected,and among them 16 with preeclampsia,14 of normal pregnancy;another 21 Tibetan puerperas delivered in Yushu Tibetan Autonomous Prefecture Hospital(an altitude of 3 700 m) during the same period were also selected,and among them 10 with preeclampsia,11 of normal pregnancy.The expression of HLA-G mRNA and protein in maternal placenta was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction(RT-PCR) and western blotting.Results There were significant differences in expression of HLA-G mRNA and protein among puerperas in different situations(P<0.05).The expression of HLA-G mRNA and protein among Han puerperas with preeclampsia at low altitudes,Tibetan puerperas of normal pregnancy at high altitudes and Tibetan puerperas with preeclampsia at high altitudes was significantly lower than that of Han puerperas of normal pregnancy at low altitudes(P<0.05).The expression of HLA-G mRNA and protein of Tibetan puerperas with preeclampsia at high altitudes was significantly lower than that of Tibetan puerperas of normal pregnancy at high altitudes(P<0.05).The expression of HLA-G protein of Tibetan puerperas with preeclampsia at high altitudes was significantly lower than that of Han puerperas with preeclampsia at low altitudes(P<0.05),while there was no significant difference in the expression of HLA-G mRNA and protein between Han low-altitude puerperas with preeclampsia and Tibetan high-altitude puerperas of normal pregnancy(P>0.05).There was no significant difference in the expression of HLA-G mRNA between Han low-altitude puerperas with preeclampsia and Tibetan high-altitude puerperas with preeclampsia(P>0.05).Conclusion The chronic hypoxia environment in plateau may affect the expression of HLA-G gene.The differential expression of HLA-G in Tibetan and Han nationalities at different altitudes may play an important role in the pathogenetic process of preeclampsia in Qinghai plateau area,and is one of the causes of high incidence of preeclampsia in the plateau region.

Pre-eclampsia;HLA antigens;Altitude;Zang nationality;Han nationality

青海省(应用)基础研究计划项目(2013-Z-736)

R 714.24

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.16.015

2016-12-03；

2017-03-20)

1.810001 青海省西宁市，青海大学附属医院产科

2.810000 青海省西宁市，青海红十字医院产科

*通信作者：谢莹莺，主任医师，硕士生导师；E-mail：xyy09001@163.com