Raf—1、MEK—2、ERK—1在胃癌组织中的表达及其意义

姜浩+孙治国

[摘要] 目的 探討Raf-1、MEK-2、ERK-1在胃癌组织中的表达形式及其意义，并分析此种信号途径与胃癌的临床病理特征之间是否存在联系，并为胃癌抗EGFR靶向治疗的分子标志物筛选提供依据。 方法 通过免疫组化中SP法检测60例胃癌患者标本胃癌组织和正常的胃组织中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表达水平并进行比对。 结果 经统计60例胃癌组织当中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表达率分别为88.33%（53/60）、85.00%（51/60）、78.33%（47/60）。而正常的胃组织当中Raf-1、MEK-2、ERK-1均未见到阳性表达。被胃癌细胞转移的淋巴结组织中Raf-1、MEK-2、ERK-1的阳性表达率更为显著，分别高达95.12 %（39/41），90.24 %（37/41），87.80 %（36/41）。未见癌细胞转移的淋巴结中Raf-1、MEK-2、ERK-1均无表达。实验证实Raf-1、MEK-2、ERK-1的表达水平与胃癌的临床特征中的肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移以及TNM分期有明显相关性（P<0.05）。 结论 （1）人体胃癌组织当中存在Raf/MEK/ERK信号通路的激活；（2）人体胃癌组织中Raf/MEK/ERK信号通路的活化程度与胃癌组织的临床病理特征相关，此信号通路活化程度越高的胃癌组织，其分化的程度越低，TNM分期越高。三者联合检测可为研究胃癌的生物学行为乃至对靶向治疗胃癌提供十分重要的参考依据及指标。

[关键词] 胃癌；Raf-1；MEK-2；ERK-1；Raf/MEK/ERK；免疫组化

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）15-0030-04

[Abstract] Objective To investigate the expression pattern and significance of Raf-1， MEK-2 and ERK-1 in gastric carcinoma and analyze whether there is a link between this signaling pathway and the clinicopathological features of gastric cancer，and to provide the basis for the screening of molecular markers for gastric cancer anti-EGFR targeted therapy. Methods The expression levels of Raf-1， MEK-2 and ERK-1 in gastric cancer tissues and normal gastric tissueswere detected by SP immunohistochemical method and compared in 60 patientswith gastric cancer. Results The expression rates of Raf-1， MEK-2 and ERK-1were 68.33% （53/60）， 85.00% （51/60） and 78.33% （47/60） respectively in 60 cases of gastric cancer. However， the positive expressions of Raf-1， MEK-2 and ERK-1 were not observed in normal gastric tissues. The positive expression rates of Raf-1， MEK-2 and ERK-1 in lymph node metastasis of gastric cancer cells were 95.12%（39/41）， 90.24%（37/41）， 87.80%（36/41）， which were significantly higher. Raf-1， MEK-2 and ERK-1 were not expressed in lymph nodes without lymph node metastasis. The expression levels of Raf-1， MEK-2 and ERK-1 were significantly correlated with the degree of tumor differentiation， depth of invasion，lymph node metastasis and TNM staging in the clinical features of gastric cancer（P<0.05）. Conclusion （1） The activation of Raf/MEK/ERK signaling pathway is existed in human gastric cancer tissues； （2）The activation degree of Raf/MEK/ERK signaling pathway in human gastriccancer tissue is related to clinicopathological features of gastric cancer tissue. The higher the degree of activation of this signal pathway in gastric cancer tissues， the lower the degree of differentiation， and the higher the TNM staging. The combined detection of the three can provide a very important reference and indicator for the study of the biological behavior and the targeted treatment of gastric cancer.

[Key words] Gastric cancer； Raf-1； MEK-2； ERK-1； Raf/MEK/ERK； Immunohistochemistry

胃癌是最常见的恶性肿瘤，目前死亡率很高，居世界第三位[1]。全世界范围内胃癌预后欠佳，其原因是发现病灶较晚，以致晚期胃癌比例较大。而且晚期胃癌对所有传统治疗效果均欠佳，包括化学治疗、手术切除、以及放化疗联合等[2]。近些年，以肺癌、乳腺癌、结直肠癌为代表的实体肿瘤，已经进入分子靶向治疗的新时代。目前，探索和研究胃癌的分子靶向治疗有很大发展前景。其中EGFR（表皮生长因子受体）是目前研究的主要靶点之一，它与肿瘤的转移和血管形成有关[3]，但直至目前，世界范围内还没有公认的预测胃癌抗EGFR靶向治疗的分子标志物[4]，Raf/MEK/ERK信号通路是目前已经明确的EGFR调节通路中十分重要的一个，在胃癌组织的代谢、增殖、生长、分化、凋亡过程中起到重要的作用。国内外对Raf/MEK/ERK信号通路的研究和报道很少，本文通过研究Raf-1、MEK-2、ERK-1在胃癌组织中的表达情况，以此判断胃癌的生物学特性，为寻找胃癌中抗EGFR靶向治疗的肿瘤分子标记物进行初步探索。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取我院2012年1月～2014年12月行胃癌手术的患者60例，男45例，女15例，年龄31～78岁，中位年龄55岁。所有患者均为首次手术，且手术前均未接受放、化疗及免疫治疗，临床和病理资料均完整。

1.2 试剂

第一抗体为浓缩型兔抗人多克隆抗体Raf-1、MEK-2、ERK-1，工作浓度1∶400（美国GeneTex生物技术公司）。第二抗体为即用型生物素标记的羊抗兔IgG（福州迈新生物技术有限公司）。

1.3 方法

60例胃癌标本分为癌组织、正常胃组织、转移淋巴结、未转移淋巴结共四组，其中正常胃组织60例、胃癌组织60例、癌细胞转移淋巴结41例、未见癌细胞转移淋巴结19例。每组实验标本均经10%的中性福尔马林浸泡固定，后以石蜡包埋，分别制成4 μm厚切片5张，其中一张标本行常规HE染色，供组织学观察并且行病理诊断和分型，另外一张采用PBS法取代第一抗体行免疫组化染色作为阴性对照片，阳性对照采用已知阳性片为标准，剩余3张按抗体试剂说明书染色，步骤采用SP法进行免疫组化染色。

1.4 结果判断[5]

由两位资深病理科医师分别观察每张标本切片后进行综合分析判断。光学显微镜下观察，首先根据细胞的染色程度进行计分，细胞无显色计0分；浅黄色计1分；棕黄色计2分；棕褐色计3分。再在高倍显微镜下随机选取10个视野，记录其中阳性细胞数占细胞总数的百分比，取其平均值，根据阳性细胞所占细胞总数的比值记分：0：0分；≤25%：1分；26%～50%：2分；51%～75%：3分；>75%：4分。标本细胞的染色程度记分与阳性细胞比例计分的和为每例标本的最终积分。0分阴性（-），2～3分弱阳性（+），4～5分中度阳性（++），6～7分强阳性（+++）。

1.5 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件包进行分析，对数据采用精确概率检验、χ2检验与Spearman等级相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织及正常的胃组织中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表达

Raf-1、MEK-2、ERK-1染色主要都位于细胞浆中，呈现出浅黄色、棕黄色及棕褐色的着色，以团簇状或散在进行分布，（见封三图4分别为A、B、C），60例胃癌组织标本中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表达均呈阳性，表达率分别为88.33%（53/60）、85.00%（51/60）、78.33%（47/60），而正常的胃组织中三种蛋白均无表达。

2.2 淋巴结中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表达

Raf-1、MEK-2、ERK-1染色位同样位于转移淋巴结癌细胞的细胞浆中，呈现出淡黄色至棕黄色及棕褐色的着色，以团簇状或散在进行分布，（见封三图4分别为D、E、F），癌细胞转移的淋巴结组织中Raf-1、MEK-2、ERK-1的阳性表达率分别为95.12%（39/41），90.24%（37/41），87.80%（36/41），无癌细胞转移的淋巴结组织中均未表达。

2.3 Raf-1、MEK-2、ERK-1的表達与胃癌临床病理特征之间的关系

见表1。

2.4 Raf-1、MEK-2、ERK-1在胃癌组织中及转移淋巴结中的表达

60例胃癌患者中，男45例，Raf-1阳性表达40例，阴性表达5例，Mek-2阳性表达38例，阴性表达7例，Eek-1阳性表达36例，阴性表达9例。女性15例，Raf-1阳性表达13例，阴性表达2例，Mek-2阳性表达13例，阴性表达2例，Eek-1阳性表达11例，阴性表达4例，差异无统计学意义（P>0.05）。年龄>55岁的37例，Raf-1阳性表达32例，阴性表达5例，Mek-2阳性表达32例，阴性表达5例，Eek-1阳性表达29例，阴性表达8例。年龄≤55岁的23例，Raf-1阳性表达21例，阴性表达2例，Mek-2阳性表达19例，阴性表达4例，Eek-1阳性表达18例，阴性表达5例，差异无统计学意义（P>0.05）。肿瘤位于胃底/贲门的16例，Raf-1阳性表达14例，阴性表达2例，Mek-2阳性表达13例，阴性表达3例，Eek-1阳性表达12例，阴性表达4例。肿瘤位于胃窦/胃体的44例，Raf-1阳性表达39例，阴性表达5例，Mek-2阳性表达38例，阴性表达6例，Eek-1阳性表达35例，阴性表达9例，差异无统计学意义（P>0.05）。60例癌组织中，Raf-1阳性表达53例，阴性表达7例，Mek-2阳性表达51例，阴性表达9例，Eek-1阳性表达47例，阴性表达13例，60例正常胃组织中，Raf-1、Mek-2、Eek-1均未表达，P<0.05差异有统计学意义。中分化34例，Raf-1阳性表达28例，阴性表达6例，Mek-2阳性表达26例，阴性表达8例，Eek-1阳性表达23例，阴性表达11例。低分化26例，Raf-1阳性表达24例，阴性表达2例，Mek-2阳性表达22例，阴性表达4例，Eek-1阳性表达21例，阴性表达5例，差异无统计学意义（P>0.05）。肿瘤浸润深度T1/T2期27例，Raf-1阳性表达21例，阴性表达6例，Mek-2阳性表达20例，阴性表达7例，Eek-1阳性表达18例，阴性表达9例。肿瘤浸润深度T3/T4期33例，Raf-1阳性表达32例，阴性表达1例，Mek-2阳性表达31例，阴性表达2例，Eek-1阳性表达29例，阴性表达4例，差异无统计学意义（P>0.05）。TNM分期I+II 21例，Raf-1阳性表达16例，阴性表达5例，Mek-2阳性表达14例，阴性表达7例，Eek-1阳性表达12例，阴性表达9例。TNM分期Ⅲ+Ⅳ39例，Raf-1阳性表达37例，阴性表达2例，Mek-2阳性表达35例，阴性表达4例，Eek-1阳性表达33例，阴性表达6例，差异无统计学意义（P>0.05）。有淋巴结转移41例，Raf-1阳性表达39例，阴性表达2例，Mek-2阳性表达37例，阴性表达4例，Eek-1阳性表达34例，阴性表达7例。无淋巴结转移19例，Raf-1、Mek-2、Eek-1均未表达，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

Raf/MEK/ERK是我们已经知道的EGFR最重要的调节传导通路之一[6-10]。Raf/MEK/ERK通路可以通过磷酸化的活化方式将多种细胞外信号逐级传递至细胞核，激活多种转录因子，在细胞增殖、分化、生长抑制乃至细胞凋亡中都起着尤为重要的调控作用[11]。本实验采用免疫组织化学SP法检测60例胃癌患者标本中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表达水平，实验结果表明Raf-1、MEK-2、ERK-1在胃癌组织中的阳性表达显著高于正常胃组织，并且三者之间的阳性表达趋势完全一致，呈正相关性，充分证明了Raf/MEK/ERK信号通路在人体胃癌组织中被激活，并且提示它们在诱导人体胃癌细胞的基因转录与表达，及在促进胃癌细胞增殖及转移过程中存在承担信号传导的协同作用，其具体联系机制尚有待进一步研究。

在被胃癌细胞转移的淋巴结组织中Raf-1、MEK-2、ERK-1明显升高，而未被胃癌细胞转移的淋巴结组织中无表达。Tan等[12]对人和仓鼠的胰腺癌细胞株进行研究时发现，当诱导胰腺癌细胞岛状集落解离时，胰腺癌细胞中ERK蛋白的表达也明显升高，所以推断MEK/ERK信号通路可能起到诱发人或仓鼠胰腺癌细胞解离、促进胰腺癌细胞的侵袭和转移。Viala等[13]则认为激活后的ERK信号通路能起到增强肿瘤细胞运动及促进肿瘤细胞转移的作用。

我们进一步发现，Raf-1、MEK-2、ERK-1的阳性表達与人体胃癌细胞的分化程度、浸润深度及TNM分期都显著相关（P<0.05），而与患者年龄、性别、肿瘤生长部位尚无相关性（P>0.05）。在侵及胃浆膜层的胃细胞癌中，Raf-1、MEK-2、ERK-1阳性表达率要明显高于未侵及胃浆膜层者（P<0.05），病理分型为低分化的人胃癌组织细胞中Raf-1、MEK-2、ERK-1阳性表达率高于分型为中分化的人胃癌组织（P<0.05），临床分期为Ⅲ、Ⅳ期的人胃癌组织中Raf-1、MEK-2、ERK-1阳性表达率均高于Ⅰ期和Ⅱ期（P<0.05），研究证明人胃癌组织细胞中Raf/MEK/ERK信号通路的活化程度与人体胃癌组织的临床及病理特征存在关联，Raf-1、MEK-2、ERK-1阳性表达率越高的胃癌组织分化程度越低，其侵袭性越大，引起淋巴结转移的倾向越高，TNM分期也越高，足以证明被激活的Raf/MEK/ERK信号通路参与人体胃癌组织的浸润及淋巴结转移。而随着肿瘤的浸润、转移能力的增强和病情的进展，Raf-1、MEK-2、ERK-1表达也增强，这与Meng等[14]关于Raf-1在人体胃癌组织细胞中导致肿瘤分化、生长、浸润、转移的研究结果相一致。James等[15]研究发现ERK阻断剂PD98059抑制ERK活化后，细胞周期G1/S期转化明显抑制，针对性的抑制Raf/MEK/ERK传导通路的活化将有助于抑制肿瘤细胞的异常表达，达到及早控制肿瘤的目的，进一步辅助胃癌的早期治疗。

同时我们还发现，Raf-1、MEK-2、ERK-1三者在胃癌组织中高表达的同时，其阳性表达率有逐步衰减趋势，可能在EGFR/Raf/MEK/ERK传导通路中有其他因素发挥抑制其表达的作用，Steelman等[16]研究证明抗白血病治疗时，通过药物抑制剂作用于Raf/MEK/ERK传导通路中作用点之间通路，可以有效地控制这一途径表达，提高白血病疗效。我们下一步研究计划准备寻找这些因素，并将其抑制作用扩大，有针对性地抑制Raf/MEK/ERK信号通路的传导，阻止或延缓肿瘤的发生，针对胃癌抗EGFR的靶向治疗研究正逐步兴起，对Raf/MEK/ERK信号通路进行探索，这些因素极有可能为胃癌抗EGFR靶向治疗的分子标志物筛选提供依据，也可能成为治疗胃癌的新靶点。

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