口虾蛄提取物对人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP增殖、耐药的影响及机制

邵松军，方海燕,段玲弟，袁国航，张湘燕,郭兵

(1贵州医科大学附属省人民医院，贵阳 550002；2贵州医科大学；3贵州省第二人民医院)

·论著·

口虾蛄提取物对人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP增殖、耐药的影响及机制

邵松军1,2，方海燕3,段玲弟2，袁国航1，张湘燕1,郭兵2

(1贵州医科大学附属省人民医院，贵阳 550002；2贵州医科大学；3贵州省第二人民医院)

目的 观察口虾蛄乙酸乙酯提取物(ESO)对人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP增殖、耐药的影响，并探讨其机制。方法 选取人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP，用不同浓度(0、200、400、800 μg/mL)的ESO干预细胞，24 h后，采用MTT法测算细胞增殖抑制率，流式细胞技术测算细胞周期百分率。采用流式细胞技术观察400 μg/mL ESO干预0、30、60 min细胞内荧光染料罗丹明123(Rh123)蓄积和外排情况。采用Western blotting法检测不同浓度ESO干预24 h后细胞多药耐药蛋白1(MDR1)，并检测400 μg/mL ESO干预2、4、8 h后细胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白。结果 200、400、800 μg/mL的ESO干预细胞增殖抑制率分别为19.940%±0.041%、37.360%±0.024%、42.510%±0.008%，两两相比P均<0.01。0、200、400、800 μg/mL ESO干预细胞G2/M期分别为24.06%±2.22%、31.10%±0.79%、35.64%±1.15%、43.19%±0.43%，两两相比P均<0.01。Rh123在ESO干预细胞内积累增多、外排减少，且60 min时较30 min时明显(P均<0.01)。0、200、400、800 μg/mL ESO干预细胞MDR1蛋白相对表达量分别为1.22±0.23、0.83±0.16、0.37±0.09、0.31±0.04，两两相比P均<0.01。ESO干预不同时间A549/DDP细胞ERK1/2蛋白表达无变化，p-ERK1/2蛋白表达上调(P均<0.01)。结论 ESO通过使A549/DDP细胞发生周期阻滞，从而抑制其增殖；通过调节MAPK-ERK1/2信号通路，使其多药耐药发生逆转。

口虾蛄；非小细胞肺癌；多药耐药1；细胞外调节蛋白激酶1/2蛋白

肺癌发病率高，其中非小细胞肺癌占75%～85%[1]。目前化疗药物靶向性差，容易产生耐药，治疗效果并不显著。因此，寻找天然、高效、低毒、低价的抗肿瘤药物对肿瘤的防治和治疗、提高中晚期肿瘤患者的生存质量意义重大[2]。口虾蛄俗名濑尿虾，是极为常见的一种海洋生物。既往研究[3～6]发现，口虾蛄的乙醇粗提取物、乙酸乙酯提取物(ESO)对鼻咽癌细胞株有明显的增殖抑制作用，抑制作用主要与口虾蛄中的生物碱和蛋白多肽类物质有关。但口虾蛄提取物是否有广谱抗癌的特性，是否对耐药的肺癌细胞增殖有抑制作用，是否对耐药的肺癌细胞有多药耐药逆转效应未见报道。2015年12月～2016年12月，本研究观察了ESO对人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP的增殖、耐药的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂 胎牛血清、DMEM/High Glucose细胞培养基购于Gibco公司，顺铂购于齐鲁制药有限公司，DMSO、MTT购于Sigma公司，多药耐药蛋白1(MDR1)抗体购于Santa生物技术有限公司，p-ERK1/2、ERK1/2抗体购于Cell Signaling Technology生物技术有限公司。

1.2 ESO提取及配置 于广东湛江东风市场购新鲜的口虾蛄80 kg，用烘箱烘干，高效粉碎机粉碎后称重。采用湿法提取口虾蛄抗肿瘤有效活性成分。先以95%食用乙醇浸泡数次，直到浸泡液颜色变澄清。每次浸泡48 h，每3 h搅拌1次，共用乙醇溶液60 L，浸泡液用离心机离心留取上清液。将浸泡液混匀，然后用旋转蒸发仪在56 ℃恒温下旋转蒸发，得到乙醇粗提取物。乙醇粗提取物按1∶3加水，在60 ℃下搅拌，待分液漏斗中有乳浊液分层出现，向其加入一半体积的乙酸乙酯，充分震荡、静置数分钟到数小时；待明显分层后，打开分液漏斗旋塞，将下层乳浊液流入烧杯中，上层黄色澄清溶液即为乙酸乙酯萃取层，黄色澄清溶液经旋转蒸发仪减压浓缩得到黄褐色膏状物，即为乙酸乙酯提取物。共得到乙醇粗提取物1.7 kg，乙酸乙酯提取物0.14 kg，口虾蛄提取物提取率为0.175%[6]。采用DMSO将ESO配置成1 g/mL母液,分装于4 ℃冰箱保存，临用前用含血清的培养基稀释成所需终浓度(0、200、400、800 μg/mL)。处理细胞时，DMSO的最终浓度小于0.1%，该浓度不引起细胞生物学性状改变。

1.3 细胞株来源及培养 人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP由广东医科大学附属医院中心实验室惠赠，最大耐药倍数2.47。用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养A549/DDP，用终浓度为1.2 μmol/L的顺铂维持其耐药性。在温度为37 ℃、含5% CO2的培养箱培养，用0.25%含DTT的胰蛋白酶消化、传代细胞，取对数生长期细胞用于实验。

1.4 细胞增殖抑制率测算 采用MTT法。取对数生长期A549/DDP细胞接种于96孔培养板，每孔约含5 000个细胞；空白对照为不含细胞的等量完全培养基。待细胞贴壁后，阴性对照中仅加入等体积的培养基，干预组中各孔分别加入终质量浓度为200、400、800 μg/mL的ESO。每个浓度设5个复孔。培养24 h后，每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT，继续培养4 h。弃掉培养液，每孔加入150 μL的DMSO，平板摇床低速振荡10 min，酶标仪570 nm波长下测定其吸光度(A)值，实验重复3次。细胞抑制率(%)=[1-(干预组A值-空白对照A值)/(阴性对照A值-空白对照A值)]×100%。

1.5 细胞周期检测 采用流式细胞术。取对数生长期的A549/DDP细胞(1×106/孔)，置于6孔板中，待细胞贴壁、铺满后，予不同浓度(0、200、400、800 μg/mL)ESO干预后继续培养24 h。胰酶消化，离心(1 000 r/min)，PBS洗2次，-20 ℃预冷的70%乙醇固定，置于4 ℃冰箱过夜保存。取出固定细胞样本，离心(1 500 r/min)弃乙醇，PBS洗2次，将细胞重悬于0.2 mL冷PBS中，然后加入0.5 mL已配好的碘化丙啶(PI)染色液，置于4 ℃冰箱避光染色30 min，350目尼龙膜过滤。用流式细胞仪测定各组细胞DNA的含量，然后用细胞周期分析软件进行分析，得出细胞周期百分率。

1.6 细胞MDR1蛋白功能活性检测 采用流式细胞术检测罗丹明123(Rh123)在细胞内积累、外排的荧光强度，以代表MDR1蛋白的转运功能。Rh123的激发波长507 nm，发射波长529 nm。实验分为阴性对照组及干预组，取对数生长期的A549/DDP细胞(1×106/孔)，置于6孔板中，用含有5 μmol/L的Rh123培养液于37 ℃、5% CO2培养箱中分别培养0、30、60 min。每个时间点离心收集细胞，用冷PBS洗2遍，然后重悬于0.5 mL冷的PBS中，置于冰上，采用流式细胞仪检测Rh123的荧光峰。干预组需在不含Rh123培养液中加入400 μg/mL的ESO，余处理同前。

1.7 细胞MDR1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白检测 采用Western blotting法。检测不同浓度(0、200、400、800 μg/mL)ESO干预24 h后细胞MDR1蛋白；检测400 μg/mL ESO干预2、4、8 h后细胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白。提取总蛋白，样品进行SDS-PAGE后转膜。转膜条件为300 mA、恒电流90 min。5%脱脂奶粉封闭1 h，然后加入1 mL一抗MDR1(1∶1 000)、ERK1/2(1∶1 000)、p-ERK1/2(1∶1 000)、β-actin(1∶4 000)，4 ℃孵育过夜，回收一抗，TBST洗膜3次，每次10 min。分别加入2 mL二抗(1∶5 000),室温孵育2 h,TBST洗膜3次，每次10 min，ECL发光液发光成像，用凝胶图像分析软件分析灰度值。

2 结果

2.1 不同浓度ESO干预细胞增殖抑制率比较 200、400、800 μg/mL的ESO干预细胞增殖抑制率分别为19.940%±0.041%、37.360%±0.024%、42.510%±0.008%，两两相比P均<0.01。

2.2 不同浓度ESO干预细胞周期百分率比较 见表1。

表1 不同浓度ESO干预细胞周期百分率比较

注：与0 μg/mL相比，*P<0.01；与200 μg/mL相比，▲P<0.01；与400 μg/mL相比，#P<0.01。

2.3 各组细胞Rh123积累、外排的荧光强度比较 见表2。

2.4 不同浓度ESO干预细胞MDR1蛋白表达比较 0、200、400、800 μg/mL的ESO干预细胞MDR1蛋白相对表达量分别为1.22±0.23、0.83±0.16、0.37±0.09、0.31±0.04，两两相比P均<0.01。

表2 各组细胞Rh123积累、外排的荧光强度比较

注：与阴性对照组相比，#P<0.01；与干预组0 min时相比，*P<0.01；与干预组30 min时相比，▲P<0.01。

2.5 ESO干预不同时间细胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达比较 见表3。

表3 ESO干预不同时间细胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达比较

注：与0 h时相比，*P<0.01；与2 h时相比，▲P<0.01；与4 h时相比，#P<0.01。

3 讨论

肺癌是目前全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一[7]。2012年,我国肺癌病死率和发病率均位列恶性肿瘤第一,年发病和死亡病例为70.5万和56.9万[8]。肿瘤化疗研究进展提示，各类化疗药物通过对细胞周期调控，诱导肿瘤细胞凋亡，以达到控制肿瘤增殖的目的[9]。大量临床研究数据表明，采用单一化疗药物治疗肺癌效果并不显著，且易产生耐药。虽已经开发了针对MDR1蛋白靶点的分子靶向药物，但因其不良反应多，易发生耐药，而退居二线。

中药临床疗效明显，其不良反应少，在逆转肿瘤的多药耐药方面已成为研究热点，中药单体及多种成分均具有逆转肺癌多药耐药的作用[10～12]。多药耐药是指肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药的同时,对之前未接触过的多种抗肿瘤药物同样产生耐药。肿瘤细胞产生耐药是中晚期癌症患者治疗失败的主要原因，耐药分子机制十分复杂，涉及膜转运蛋白介导的药物外排泵机制、相关耐药蛋白过表达、酶类介导的肿瘤细胞解毒及修复功能增强、凋亡调控基因异常、信号转导因子发挥抗凋亡机制、肿瘤干细胞靶点表达缺失等多种因素[13～15]。有学者认为细胞间黏附作用介导肿瘤耐药，但多数学者认为肿瘤耐药主要与MDR1蛋白在肿瘤细胞中过度表达并介导药物外排有关。本研究结果发现，ESO对A549/DDP细胞增殖有抑制作用，且随着ESO浓度的增加作用不断增强。既往研究表明，ESO通过阻滞细胞周期S期而抑制细胞有丝分裂，从而抑制肝癌细胞增殖。何欣等[16]发现丹参酮ⅡA能显著降低肿瘤患者体内MDR1蛋白、TOPOⅡ的表达，从而提高抑瘤率及肿瘤细胞的凋亡率。刘盛楠等[17]发现白藜芦醇能够抑制肺癌细胞A549的生长，诱导其凋亡。ESO对A549/DDP细胞增殖抑制，是否与细胞周期阻滞及促进其凋亡有关？本研究采用流式细胞技术对其细胞周期进行检测，结果发现，经ESO干预的A549/DDP细胞，其G2/M期发生周期阻滞，随着ESO浓度的增加阻滞作用不断增强。可见，ESO主要通过调控A549/DDP细胞周期，从而抑制其增殖。

唐晓勇等[18]发现浙贝母碱对A549/DDP有多药耐药的逆转作用,其可能是通过截断细胞外膜肺耐药相关蛋白(LRP)的胞内药物外排泵功能及诱导细胞凋亡，从而发挥逆转肿瘤多药耐药活性的作用。Li等[19]发现，胡椒碱对A549/DDP有明显的增敏作用，且能逆转其多药耐药，逆转倍数达14.4倍，其逆转机制可能与抑制多药耐药蛋白、多药耐药相关跨膜蛋白(MRP)的表达，从而增加细胞内化疗药物的蓄积或减少清除，并下调ABCG2、ABCB1等耐药基因的表达有关。本研究结果显示，Rh123在ESO干预A549/DDP细胞内积累增多、外排减少，且60 min时较30 min时明显，可见ESO可以在细胞内蓄积或清除减少，实现耐药逆转。本研究结果发现，A549/DDP耐药细胞经ESO干预后，MDR1蛋白表达下调,随ESO浓度的增加蛋白下调更明显。而ESO干预不同时间A549/DDP细胞ERK1/2蛋白表达无变化，p-ERK1/2蛋白表达上调，表明MAPK-ERK信号通路激活，调节了ESO对细胞的敏感性，其机制有待进一步研究。下一步我们将采用qRT-PCR检测MDR1基因表达，以及敲低或RNA干扰MDR1基因，或使用MDR1基因及ERK1/2信号通路抑制剂进行干预，或加入ATP酶活性抑制剂干预，检测MRP、乳腺癌耐药蛋白、LRP等多个耐药蛋白表达，进一步探讨ESO与耐药逆转的关系，明确其作用机制。

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Effects of ESO extracts on proliferation and drug resistance of human lung adenocarcinoma drug-resistant cell line A549/DDP

SHAOSongjun1,FANGHaiyan,DUANLingdi,YUANGuohang,ZHANGXiangyan,GUOBing

(1GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,China)

Objective To observe the effects of ethyl acetate extracts of Squilla oratoria (ESO) on proliferation and drug resistance of human lung adenocarcinoma drug-resistant cell line A549/DDP and to investigate its mechanism. Methods We selected the A549/DDP cell line, which were treated with different concentrations of ESO (0, 200, 400, 800 μg/ml) for 24 h. The proliferation inhibition rates of A549/DDP cells were detected by MTT assay. The cell cycle percentage was determined by flow cytometry (FCM). We used FCM to detect the Rhodamine123 (Rh123) accumulation and efflux in A549/DDP cells treated with 400 μg/mL ESO for 0, 30, and 60 min. After the cells were treated with different concentrations of ESO for 24 h, the multidrug resistance 1 (MDR1) protein was detected by Western blotting. Meanwhile, we detected the ERK1/2, p-ERK1/2 protein of cells after 400 μg/mL ESO treatment for 2, 4, and 8 h.Results The proliferation inhibition rates of A549/DDP cells treated with 200, 400, and 800 μg/mL ESO were 19.940%±0.041%, 37.360%±0.024%, and 42.510%±0.008%, and significant difference was found between every two groups (allP<0.01). A549/DDP cells treated with 0, 200, 400, and 800 μg/mL ESO could be blocked in G2/M phase, and the proliferation inhibition rates were 24.06%±2.22%, 31.1%±0.79%, 35.64%±1.15%, and 43.19%±0.43%, respectively; significant difference was found between every two groups (allP<0.01). ESO increased the accumulation of Rh123 level of A549/DDP cells, reduced the efflux, and this change was more significant at 60 min than at 30 min (allP<0.01). The expression of MR1 protein was 1.22±0.23, 0.83±0.16, 0.37±0.09, and 0.31±0.04 in A549/DDP cells after 0, 200, 400, 800 μg/mL of ESO treatment respectively, allP<0.01. However, p-ERK1/2 protein expression was up-regulated in A549/DDP cells (P<0.01), but p-ERK1/2 protein expression had no variation at different time of ESO treatment. Conclusion ESO inhibits the proliferation of A549/DDP cells through cell cycle arrest, and reverses the multidrug resistance by regulating the MAPK-ERK1/2 signaling pathway.

Squilla oratoria; non-small-cell lung cancer; multidrug resistance 1; extracellular signal-regulated kinase 1/2 protein

贵州省科技合作计划项目(黔科合LH字2015-7126号)。

邵松军(1984-)，男，硕士，主治医师，主要从事肺癌的基础与临床研究。E-mail: 351224694@qq.com

张湘燕(1962-)，女，硕士，教授、主任医师，主要从事肺癌的基础与临床研究。E-mail: zxy35762@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.001

R285.5

A

1002-266X(2017)22-0001-04

2017-02-22)