实时荧光PCR检测肉制品中羊源性成分

□ 舒 静 陕西省产品质量监督检验研究院 孙丽君 陕西省人民医院中心实验室樊 成 严 烨 王 瑛 郑玉红 陕西省产品质量监督检验研究院

实时荧光PCR检测肉制品中羊源性成分

□ 舒 静 陕西省产品质量监督检验研究院 孙丽君 陕西省人民医院中心实验室
樊 成 严 烨 王 瑛 郑玉红 陕西省产品质量监督检验研究院

为了建立一种快速检测肉制品中羊源性成分的方法，本文根据羊特异性线粒体DNA片段，设计合成引物，通过检测引物的特异性及方法灵敏性，建立肉制品中羊源性成分实时荧光PCR检测方法。

羊源性成分；肉制品；实时荧光PCR方法

据报道，某些不法企业和个人利用鸡肉或鸭肉等廉价肉冒充牛肉、羊肉，在熟食加工时会加入香料、调味品等食品添加剂以掩盖这种造假行为，由于肉制品加工后不能用肉眼判断其种属，使假冒产品更容易被市场销售，极大的侵犯了市场消费者的合法权益[1]。食品安全是关乎大家的重大民生问题，食品掺假问题不仅涉及经济、营养价值和食品安全等方面，牛羊肉的掺假而且涉及群众宗教信仰。所以，鉴定肉制品物种源性是食品安全检测中的必要检测。

目前，针对肉类制品中的物种鉴别主要方法有高效液相色谱（HPLC）[2]、等电聚焦电泳（IEF）[3]、酶联免疫测定（ELISA）[4]等方法，但都因存在周期长、灵敏度低、不能检测熟肉加工品等缺点而未被广泛使用[5]。实时荧光PCR相比于一般PCR，检测时间短，无需琼脂糖凝胶电泳，避免产物污染和EB对实验人员的危害，具有快速简便的特点。而且无论是生熟肉还是其加工品，均可进行检测，实时荧光PCR技术已经逐步取代了一般的PCR方法[6]，已逐步成为肉类成分鉴别的主流技术[7]。本文根据羊线粒体特异基因序列设计特异性的引物，用实时荧光PCR方法检测对肉制品中羊源性成分，为食品市场快速检测肉制品中的羊源性成分构建技术平台。

1 材料与方法

1

.1 材料

1.1.1 标本

本试验的标本羊肉干、羊肉卷、生羊肉、熟羊肉等肉制加工品，均来源于当地某超市。

1.1.2 主要试剂

Tissue DNA Kit（OMEGA）和荧光PCR酶SYBRⅡ（TAKARA）。

1.1.3 主要仪器

荧光PCR仪ABI7500（life）、漩涡振荡器（大龙兴创）、NANODROP 2 000C（Thermo scientific公司）和离心机（大龙兴创）。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

根据GenBank中查询的羊源性特异性DNA序列，内参引物为动物共同的一段保守序列，设计合成一对对特异性引物及一对内参引物，由华大公司合成，其序列见表1。

1.2.2 模板DNA的提取

模板DNA抽提按照OMEGA组织DNA提取试剂盒中的说明书进行抽提。

1.2.3 模板DNA含量的测定

取1 μL模板DNA，利用紫外分光光度计检测模板DNA，A260/A280比值检测在1.8～2.0，则证明抽提的核酸DNA模板质量合格。

1.2.4 多重实时荧光PCR扩增体系及条件

羊源性成分检测体系包含SYBRⅡ10 μL、模板1 μL、羊上、下游引物各0.5 μL、ddH2O 8 μL；内参检测PCR体系包含SYBRⅡ 10 μL、模板1 μL、内参上、下游引物各0.5 μL、ddH2O 8 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个cycels，PCR溶解曲线条件为60 ℃ 15 s，90 ℃ 15 s。

1.2.5 引物特异性试验

选取抽提得到的猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、驴和马的DNA，分别用羊引物进行多重实时荧光PCR方法检测，判定羊引物的特异性。

1.2.6 方法灵敏度试验

将抽提的羊肉DNA进行浓度稀释至每个模板羊肉的含量依次为20%、10%、5%、2%和1%（V︰V）5个稀释度的模板DNA进行羊源性成分的检测，验证方法的灵敏度。

1.2.7 羊源性多重实时荧光PCR方法的应用

利用本文方法检测市场上的羊肉加工样品，检测结果说明，部分与标注不符。

2 结果

2.1 结果判读

阳性结果判定：在阴性对照无荧光信号和模板内参基因Ct值小于25的条件下，羊源性检测体系中有荧光信号并且Ct值小于30，证明样本有羊源性成分，Ct大于30证明无羊源性成分。

2.2 特异性试验

利用羊源性引物对猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、驴和马的8种肉制品样本进行检测，结果见表2。检测结果显示，只有羊肉制品样本的结果为阳性，其余物种的肉制品样本均为阴性，由此可证明此方法引物特异性比较好。

2.3 灵敏度试验

用紫外分光光度计检测羊肉DNA浓度，以初始约50 ng/μL进行稀释，每个模板中羊肉的含量依次为20%、10%、5%、2%和1%，灵敏度试验重复三次。羊源性成分扩增曲线图，如图1所示。PCR检测结果说明，羊肉含量为1%时仍可检测出。

表1 引物序列表

表2 特异性检测表

图1 羊源性成分扩增曲线图（从左到右依次为20%、10%、5%、2%和1%）

表3 多重实时荧光PCR检测羊源性成分应用表

2.4 多重实时荧光PCR检测羊源性成分应用

利用建立的羊源性成分PCR检测方法，检测市售的某些羊肉产品。检测结果中，某些产品与标述不符合，检测结果见表3。

3 结论

本试验通过内参基因的检测可以避免由于模板原因而造成的结果误判，减少了假阴性的原因，如果试验结果扩增曲线不明显或者CT值在30，即可重复实验检测。目前，基于PCR和实时荧光PCR方法检测饲料和肉制品中的动物源性成分已经得到了较多的关注和研究[8-12,5]，此方法弥补了普通PCR电泳污染及费时的问题，为食品监管部门加强食品安全管理、打击肉制品市场上的以廉价肉冒充羊肉的现象提供了强有力的技术支持[13]。通过对市售羊肉制品的检测证明，此方法与行标方法检测结果一致，检测结果说明在羊肉卷和羊肉干中掺假的现象比较多，同时该方法也为肉制品中各动物源性成分含量的检测奠定了基础，保证消费者的健康及保护其合法权益。综合分析此方法快速简便经济，基本可以满足市场对羊肉制品检测的要求。

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陕西省科技计划项目（编号：2016KTCQ03-04）。

舒静（1981-），女，陕西西安人，本科，工程师，主任。研究方向：食品与微生物检验。

舒静。