祛斑中药组方干预黑素合成的主效应中药剖析

陈志春，王英豪，张理平，兰明金



祛斑中药组方干预黑素合成的主效应中药剖析

陈志春1，王英豪2，张理平2，兰明金2

1.福州屏山制药厂，福建福州 350003；2.福建中医药大学药学院，福建福州 350122

目的 解析祛斑中药组方干预黑素合成的主效应中药。方法 采用3×2析因设计，以山楂、当归、山萸肉为考察因素，各设2水平，分别测定酪氨酸酶活性抑制率、多巴色素自动氧化生成黑素量、多巴自动氧化抑制率，并运用SPSS16.0软件辅助解析祛斑组方对干预黑素合成不同途径的主效应中药。结果 组方中山萸肉对酪氨酸酶活性具有显著抑制作用（＜0.05），山萸肉、当归对多巴色素自动氧化生成的黑素量具有极显著抑制作用（＜0.01），山萸肉、当归对多巴自动氧化具有显著抑制作用（＜0.05），山萸肉在组方中贡献最大。结论 山萸肉为组方中抑制酪氨酸酶活性、多巴色素自动氧化生成黑素量、多巴自动氧化的主效应中药。

析因设计；酪氨酸酶；黑色素；祛斑中药复方；效应中药

1 仪器与试药

紫外-可见分光光度计（UV-9100，北京瑞利分析仪器公司），电子分析天平（FA20004N，上海精密科学仪器有限公司），数显水浴锅（HH.S，上海锦屏仪表有限公司），离心机（Anke TDL80-2B，厂家上海安亭科学仪器厂），微量移液器（PIPETTOR，WKY型，100～500 µL，上海求精生化试剂仪器有限公司），超声波清洗器（KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司）。

山楂（批号20140505）、当归（批号20141118）、山萸肉（批号20141023）购于福建中医药大学国医堂，经福建中医药大学车苏容副教授鉴定，分别为蔷薇科植物山楂Bge.的干燥成熟果实、伞形科植物当归（Oliv.）Diels的干燥根、山茱萸科植物山茱萸Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉。酪氨酸酶（SIGMA，CAS9002-10-2，EC232-653-4，USA，MSDS）；左旋多巴（-Dopa，西安润泽生物技术有限公司，批号060108）；盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钠、乙醇等试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 析因试验设计

参考前期研究结果[1-4]，本试验选用3×2析因设计表，以山楂、当归、山萸肉为考察因素，每个因素设2个水平，进行组方设计（见表1），得到析因设计试验方案（见表2），其中1行为1种组方，按表中各行数值取相应药味混合即得，共8组。

表1 析因设计因素水平表（g）

表2 析因设计试验方案

2.2 组方制备

将组方（山楂、当归、山萸肉等）饮片分别粉碎成粗粉（40目），分别称取适量粉末于具塞三角瓶中，加入适量乙醇，混匀，浸泡0.5 h，超声提取（功率500 W，频率40 kHz）1 h，提取2次，分别过滤，减压回收乙醇，制得浓度为250 g/L的药液，备用。

1.2 峨眉武术的历史演进挖掘 峨眉武术作为中国民族传统武术流派重要的一支，自其发展之初，便依托以中国著名的峨眉山为根基传播峨眉武术文化。《峨眉拳谱》一书中曾记载描述“一树五花，五花八叶扶，皎皎峨眉月，光辉满江湖。”[4]其中一树泛指峨眉武术，五花指巴蜀的5个地理区域，即四川省青城山的青城派，金堂云顶山的铁佛派，四川青牛山的青牛派，四川涪陵点易派以及荣昌、隆昌两地的黄林派；而八叶则指当今四川武术中普遍认同的僧门、岳门、赵门、杜门、洪门、化门、字门、会门8个著名门派。八叶与《峨嵋拳普》中记载的基本一致，泛指当今巴蜀流传的赵门、僧门、岳门、杜门四大家以及洪门、化门、字门、会门四小家。

2.3 酪氨酸酶活性测定

参考文献[6]方法，采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法检测酪氨酸酶活性，反应混合物与体积见表3，计算酪氨酸酶抑制率。酪氨酸酶抑制率（%）＝[（A475a－A475b）－（A475c－A475d）]/（A475a－A475b）×100%。式中，a为未加中药的加酶混合液，b为未加中药和酶的混合液，c为加中药和酶的混合液，d为加中药而未加酶的混合液。

表3 反应混合物与体积（mL）

2.4 多巴色素自动氧化生成黑素量测定

将酪氨酸酶试液（135 U/mL）0.5 mL在25 ℃温育10 min，加入多巴溶液（0.03%）0.5 mL，一起温育5 min，然后分别加入PBS溶解的受试物0.5 mL（500、200、50 μg/mL）并温育60 min，加入1 mol/L盐酸2 mL终止反应，将该混合物于3000 r/min离心15 min，沉淀物分别用6 mol/L盐酸1 mL洗1次、双蒸水洗2次，然后用1 mol/L NaOH溶液2 mL充分溶解离心团块，用分光光度计在400 nm处测定吸光度（OD值）。以黑素量为横坐标，OD值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程＝5.1＋0.47（＝0.999 9）。结果表明黑素量在0～160 μg/mL范围内OD值与黑素量呈良好的线性关系。通过黑素标准曲线计算各组方黑素生成量。

2.5 多巴自动氧化反应测定

将3 mL多巴溶液（0.03%）和3 mL PBS稀释过的受试物（50、10、2 mg/mL）混合，在空气中（25 ℃）暴露4 d，然后用分光光度计在475 nm处测定OD值，以PBS代替受试物作为空白对照，计算各组方对多巴自动氧化反应的抑制作用。

2.6 解析组方中主效应中药

采用SPSS16.0统计软件，指标测定结果以±表示，析因分析采用检验，＜0.05表示差异有统计学意义，分别解析祛斑中药中抑制酪氨酸酶活性、多巴色素自动氧化生成黑素量、抗多巴自动氧化反应的主效应、交互效应、单独效应。

3 结果

3.1 各组方对黑素合成的影响

各组方干预黑素合成各指标测定结果见表4。

3.2 酪氨酸酶活性抑制率析因分析

各组方酪氨酸酶活性抑制率析因分析结果显示，A、B、C因素两两交互效应中2条直线均相互平行，说明因素间不存在交互作用，即组方对酪氨酸酶的抑制不存在交互效应，故只需考虑各因素的主效应作用。由检验结果（见表5）可知，C＞B＞A，其中C因素有统计学意义（＜0.05），B、C因素无统计学意义（＞0.05）。可见，C因素（山萸肉）的贡献远大于A因素（山楂）、B因素（当归），处于绝对主导地位，尤以山萸肉水平2对酪氨酸酶活性具有显著抑制作用，是复方中酪氨酸酶活性抑制的主效应中药。

表4 各组方干预黑素合成结果

表5 酪氨酸酶抑制率析因方差分析表

3.3 多巴色素自动氧化生成黑素含量析因分析

多巴色素自动氧化生成黑素含量析因分析结果显示，A、B、C因素两两交互效应中2条直线均相互平行，说明因素间不存在交互作用，即组方抑制多巴色素自动氧化生成黑素量不存在交互效应，故只需考虑各因素的主效应作用。由检验结果（见表6）可知，B＞C＞A，其中B、C因素有统计学意义（＜0.05），A因素无统计学意义（＞0.05）。B因素（当归）、C因素（山萸肉）的贡献远大于A因素（山楂），处于绝对主导地位，其中当归水平1、山萸肉水平2对多巴色素自动氧化生成黑素量的抑制明显，是复方中抑制多巴色素自动氧化生成黑素量的主效应中药。

表6 多巴色素自动氧化生成黑素量析因方差分析表

3.4 抗多巴自动氧化反应析因分析

多巴自动氧化反应抑制试验析因分析结果显示，A、B、C因素两两交互效应中AC因素、BC因素2条直线相互不平行，说明两因素可能存在交互作用，即组方对多巴自动氧化的抑制存在交互效应，故需考虑交互作用。由检验结果（见表7）可知，B＞C＞A×C＞A＞B×C，其中B、C因素有统计学意义（＜0.05），A、A×C、B×C因素无统计学意义（＞0.05）。可见，C因素与A、B因素存在交互作用，但无显著影响，故主要分析主效应中药。C因素（山萸肉）、B因素（当归）的贡献远大于A因素（山楂），处于绝对主导地位，尤以当归水平2、山萸肉水平1对多巴自动氧化具有显著抑制作用，是复方中抗多巴自动氧化反应的主效应中药。

表7 抗多巴自动氧化反应析因方差分析表

4 讨论

色素增多性皮肤病临床最常见的有黄褐斑、老年斑、雀斑等，属中医学“黧黑斑”“面尘”“面黑皯”等范畴。目前中西医尚无具有确切疗效的良药。“气血失和，不能荣于面部皮肤而生色斑”（《本草纲目》），临床选药当辨证论治。祛斑中药组方是本课题组治疗色素增多性皮肤病的常用验方，方中当归、山楂、山萸肉等滋补肝肾、养血活血，临床治疗黄褐斑疗效确切，前期研究亦证实山楂、当归、山萸肉等药（“斑白”搽剂主成分）高、中、低3个不同浓度对酪氨酸酶活性均有很强的抑制作用[1-3]。因而，本研究根据中医理论及前期研究结果，继续采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法检测酪氨酸酶活性，并运用数学模型“析因设计法”剖析方中具有抑制酪氨酸酶活性的主效应中药，结果表明各药的酪氨酸酶活性抑制率依次为山萸肉＞当归＞山楂，山萸肉的贡献处于绝对主导地位，对酪氨酸酶活性具有显著抑制作用（＜0.05），是方中酪氨酸酶活性抑制的主效应中药。

祛斑中药组方临床治疗色素增多性皮肤病的优势为其作用的多途径、多环节，不能单靠酪氨酸酶活性抑制模型来筛选脱色剂，还应根据色素生成的许多环节进行综合评价[7-8]。黑素生成过程是一个较为复杂的过程，该过程除与酪氨酸酶相关外，还与多巴色素自动氧化、多巴自动氧化等因素密切相关。因此，本研究进行了多巴色素自动氧化生成黑素、多巴自动氧化试验的研究，以深入剖析祛斑中药干预黑素合成的主效应中药。结果显示，各药对多巴色素自动氧化生成黑素的抑制作用依次为当归＞山萸肉＞山楂，当归、山萸肉的贡献处于绝对主导地位，对多巴色素自动氧化生成黑素具有明显抑制作用（＜0.01），是方中抑制多巴色素自动氧化生成黑素的主效应中药；各药对多巴自动氧化反应的抑制依次为当归＞山萸肉＞山楂×山萸肉＞山楂＞当归×山萸肉，当归、山萸肉的贡献处于绝对主导地位，对多巴自动氧化的抑制明显（＜0.05），是方中抑制多巴自动氧化的主效应中药。

中药复方的效果是多靶点、多途径、多系统药理效应的综合表现。本研究在前期实验基础上采用析因设计与药效相结合的方法，进一步明确了祛斑中药在治疗色素增多性皮肤病方面的主效应中药或组合，研究结果从某种程度上印证了这一理论。正是由于中药复方具有多靶点、多途径、多系统的作用特点，必然存在不同作用途径的主要中药，围绕这一思路，采用析因设计法逐步明晰中药复方综合作用的物质基础，对于中药复方配伍的现代诠释具有重要意义。

[1] 张理平,张海燕,李孝栋,等.28味中药酸性成分提取物影响黑素合成的实验研究[J].中华中医药杂志,2009,24(11)：1443-1445.

[2] 陈志春,王英豪.地骨皮总黄酮的提取及酪氨酸酶活性抑制研究[J].福建中医药,2012,43(4)：54-56.

[3] 张理平.“斑白”搽剂中微量元素与氨基酸的含量及祛斑机理[J].光明中医,2004,19(6)：57-58.

[4] 张理平,陈丽,胡筱,等.外用中药斑白搽剂对黑色素产生过程中酪氨酸酶的抑制作用[J].中国临床康复,2005,9(10)：168-169.

[5] 胡良平,郭辰仪.用SAS软件实现析因设计定量资料的统计分析[J].药学服务与研究,2011,11(3)：170-173.

[6] 王英豪,陈志春,张理平,等.响应面法优化桑椹黄酮超声辅助提取工艺及对酪氨酸酶活性抑制研究[J].中国中医药信息杂志,2016,23(2)：93-97.

[7] 张海霞,梁乃龙.黄褐斑与酪氨酸酶活性的相关性研究[J].辽宁中医药大学学报,2010,12(9)：99-100.

[8] 邹宏超,付香莲.黄褐斑病因及发病机制研究进展[J].皮肤病与性病, 2010,32(4)：27-29.

Research on Main Effective Chinese MateriaMedica inPrescription for Intervention in Melanin Synthesis

CHEN Zhi-chun1, WANG Ying-hao2, ZHANG Li-ping2, LAN Ming-jin2

Objective To investigate the major effective Chinese materia medica inPrescription for intervention in melanin synthesis. Methods 3×2 factorial design was used. The factors of investigation were Crataegi Fructus, Angelicae Sinensis Radix and Corni Fructus. Tyrosinase activity, melanin generation and auto-oxidation of dopa were determinated respectively; and the major effective Chinese materia medica ofPrescription for intervention in melanin synthesis was analyzed by SPSS16.0 software. Results Tyrosinase activity was remarkably inhibited by Corni Fructus (<0.05). Melanin generation was remarkably inhibited by Corni Fructus and Angelicae Sinensis Radix (<0.01). Auto-oxidation of dopa was remarkably inhibited by Corni Fructus and Angelicae Sinensis Radix (<0.05). Corni Fructus was in an absolute leading position. Conclusion Corni Fructus is the major effective Chinese materia medica in inhibiting tyrosinase activity, melanin generation and auto-oxidation of dopa in the prescription.

factorial design; tyrosinase; melanin;Prescription; effective Chinese materia medica

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.020

R285.5

A

1005-5304(2017)07-0086-04

福建省自然科学基金（2013J01377）

王英豪，E-mail：wyhtcm@aliyun.com

（2016-11-16）

（2016-12-09；编辑：陈静）