3种活血化瘀中药复方含药血清对神经胶质瘤U251细胞JAK/ STAT信号通路的影响Δ

刘建民，黄良文，朱旭红，胡 鹏，袁淮涛（广州中医药大学第一附属医院神经外科，广州 510405）

·实验研究·

3种活血化瘀中药复方含药血清对神经胶质瘤U251细胞JAK/ STAT信号通路的影响Δ

刘建民＊，黄良文，朱旭红，胡 鹏，袁淮涛（广州中医药大学第一附属医院神经外科，广州 510405）

目的：评价3种活血化瘀中药复方含药血清对神经胶质瘤U251细胞侵袭行为及Janus激酶（JAK）/信号转导及转录激活因子（STAT）通路的影响。方法：将大鼠随机分为生理盐水组（5m L/kg）、桃红四物汤组（5.7 g/kg）、血府逐瘀汤组（8.5 g/kg）和抵挡汤组（2.8 g/kg），以生药计，每天ig给药1次，连续10 d，末次给药2 h后制备10%含药血清培养液。以10%含药血清培养液干预U251细胞1周后，采用Transwell法检测细胞侵袭率，Western blot法检测细胞中金属基质蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、磷酸化JAK2（p-JAK2）、磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白表达，实时荧光定量聚合酶链式反应法检测细胞中MMP-2、MMP-9mRNA表达。结果：与空白血清比较，血府逐瘀汤含药血清能降低细胞侵袭率（P＜0.05），下调细胞中MMP-2、MMP-9mRNA及其蛋白表达以及细胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白表达（P＜0.05或P＜0.01）；而桃红四物汤含药血清和抵挡汤含药血清作用后上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：在3种活血化瘀中药复方中，血府逐瘀汤具有显著抑制U251细胞侵袭的能力；其机制可能与抑制JAK2/ STAT3信号通路激活，下调MMP-2、MMP-9基因及蛋白表达有关。

活血化瘀；侵袭；Janus激酶/信号转导及转录激活因子信号通路；金属基质蛋白酶；胶质瘤U251细胞

恶性胶质瘤（Malignant gliomas，MGs）是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，因其高度侵袭性生长的特点而缺乏有效的治疗措施，患者预后较差，中位生存时间仅大约1年[1-3]。近年来研究表明，活血化瘀中药能够抑制肿瘤侵袭，这给MGs治疗带来了新的希望，但这些活血化瘀中药抗肿瘤侵袭的作用机制尚缺乏研究[4]。Janus激酶（JAK）/信号转导及转录激活因子（STAT）通路的过度活化与MGs细胞浸润、扩散密切相关[5]，然而活血化瘀中药抗肿瘤侵袭作用是否与调控JAK/STAT信号通路活化有关尚不清楚。基于此，本研究选用桃红四物汤、血府逐瘀汤、抵挡汤3种不同的活血化瘀作用层次的经典中药复方，从JAK/STAT信号通路磷酸化方面探讨其抗神经胶质瘤U251细胞侵袭的可能机制，为寻求治疗MGs的临床有效药物提供实验基础。

1 材料

1.1 仪器

Qwin550图像分析软件系统（德国Leica公司）；MK3酶标仪（美国ThermoLabsystems公司）；XSP-4C生物显微镜（上海彼爱姆光学仪器制造有限公司）；DYY-10C电泳仪、DYCP-33A水平电泳槽（中国北京六一仪器厂）；3K15离心机（美国Sigma公司）；7300System荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）仪（美国Agilent公司）。

1.2 药材与试剂

方中所用药材桃仁、红花、川芎、白芍、当归、熟地、生地、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡、枳壳、炙甘草、水蛭、虻虫、大黄等均购自广东康美药业股份有限公司，经笔者鉴定均为真品；10%小牛血清（广州瑞舒生物科技有限公司）；PCR引物（美国Invitrogen公司）；兔源性磷酸化JAK2（p-JAK2）、磷酸化STAT3（p-STAT3）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗均购自美国CellSignaling Technology公司；抗金属基质蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9抗体（美国SantaCruz公司）；基底膜基质（Matrigel，美国Sigma公司）。

1.3 细胞与动物

神经胶质瘤U251细胞株购自上海生物化学和细胞生物研究所；SD大鼠75只，SPF级，♂，体质量为180～220g，购自广东省医学实验动物中心[许可证号：SCXK（粤）2014-0035]。

2 方法

2.1 含药血清的制备

各方药经生药鉴定后，分别取方中药材用水煎煮2次，过滤，制成1g/mL的药液（以生药计）。将大鼠随机分为生理盐水组（5mL/kg，15只）、桃红四物汤组（5.7 mL/kg，20只）、血府逐瘀汤组（8.5mL/kg，20只）和抵挡汤组（2.8mL/kg，20只），以生药药液ig给药，各给药组给药剂量均按体表面积法折算的人临床等效剂量[6]，每天1次，连续10d。末次给药2h后采血，以离心半径为6.2cm、3000r/min离心20min，合并同组大鼠血清，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，用1640培养基配成10%含药血清培养液，4冰箱保存，备用。

2.2 细胞培养及含药血清干预

将U251细胞接种于含10%小牛血清、100u/mL青霉素和链霉素的1640培养基中培养，细胞密度为2×104个/mL，在37、5%CO2条件下培养。取对数生长期细胞，空白血清组加入生理盐水组大鼠血清培养液，桃红四物汤血清组、血府逐瘀汤血清组和抵挡汤血清组分别加入已制备的10%相应含药血清培养液，然后置于37、5%CO2孵箱中继续培养，持续干预1周收获细胞继续试验。

2.3 Transwell法检测细胞侵袭能力

2.4 Westernblot法检测细胞中MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达

使用含抑肽酶的缓冲液对细胞进行匀浆处理，离心获取质膜碎片，随后用1%TritonX-100溶解匀浆，采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。将10μg蛋白加入Laemmli样品缓冲液（1∶1）混合，强力混匀，置100的水浴箱中水浴加热5min，随后经4%～20%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离。采用半干式电转印法将蛋白转入聚偏二氟乙烯膜，10%脱脂奶室温封闭转印2h，放入杂交袋中，加入一抗稀释液（根据抗体敏感性稀释），封口，4孵育过夜，随后洗膜3次，每次10min；加入HRP标记的二抗，室温放置1h后洗膜3次，每次10min，使用HRP法在KodakX-OmatAR胶片上检测。用Image-ProPlusVersion6.0软件进行分析，以目的蛋白灰度值与内参β-actin灰度值的比值表示蛋白表达的水平。试验重复6次。

2.5 RT-PCR法检测细胞中MMP-2、MMP-9mRNA的表达

从细胞中提取总RNA，取80ng总RNA合成cDNA。经过95预变性5min，循环内95变性30s，58退火30s，72延伸30s，PCR反应30个循环后72再延伸10min，然后4保存，完成普通PCR反应。RT-PCR检测反应体系：2×MixSYBRGreenⅠ荧光反应液10μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.25μL，样品模板1μL，用灭菌水补足体积至20μL。反应条件：95预变性2min；循环内95变性30s，60退火35 s，设置40个循环，并在每个循环延伸末端点收集荧光信号，绘制扩增曲线；40个循环后设置（95、15s，60、30 s，95、15 s）反应步骤，并对60～95升温整个过程进行全程荧光信号收集，绘制融解曲线，使用β-actin作为内参基因，根据2－ΔΔct公式计算目的基因相对表达量[其中，Δct＝目标基因ct－内参基因ct]，试验重复6次。引物序列及产物大小见表1。

表1 基因引物序列及产物大小Tab 1 Primer sequencesand sizesofgenes

2.6 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行统计学分析。数据均以±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 活血化瘀中药复方含药血清对U251细胞侵袭的影响

桃红四物汤含药血清组、血府逐瘀汤含药血清组和抵挡汤含药血清组细胞侵袭率分别为（88.96±3.38）%、（29.61±2.56）%、（95.56±2.07）%（n＝6），与空白血清组比较，血府逐瘀汤含药血清组细胞侵袭率显著降低细胞侵袭能力观察结果见图1。

图1 各组细胞侵袭能力观察结果（×200）Fig 1 Resu lts of cell invasive ability in each group（× 200）

3.2 细胞中MMP-2、MMP-9、p-JAK 2、p-STAT3蛋白表达测定结果

与空白血清组比较，血府逐瘀汤含药血清组细胞中MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达均显著减弱（P＜0.05），而桃红四物汤含药血清组和抵挡汤含药血清组差异无统计学意义（P＞0.05），蛋白表达电泳图见图2、测定结果见表2。

图2 各组细胞中MMP-2、MMP-9、p-JAK 2、p-STAT3蛋白表达的电泳图Fig 2 Electrophoretogram s of MMP-2，MMP-9，p-JAK 2，p-STAT3 protein expressions in cells of each group

表2 各组细胞中MMP-2、MMP-9、p-JAK 2、p-STAT3蛋白表达测定结果（±s，n＝6）Tab 2 ResultsofMMP-2，MMP-9，p-JAK 2，p-STAT3 protein expressions in cellsof each group（±s，n＝6）

表2 各组细胞中MMP-2、MMP-9、p-JAK 2、p-STAT3蛋白表达测定结果（±s，n＝6）Tab 2 ResultsofMMP-2，MMP-9，p-JAK 2，p-STAT3 protein expressions in cellsof each group（±s，n＝6）

注：与空白血清组比较，＊P＜0.05Note：vs.blank serum group，＊P＜0.05

p-STAT3 0.602±0.019 0.412±0.014 0.127±0.011＊0.411±0.015组别空白血清组桃红四物汤含药血清组血府逐瘀汤含药血清组抵挡汤含药血清组MMP-2 0.685±0.022 0.458±0.016 0.022±0.009＊0.405±0.022 MMP-9 0.808±0.020 0.613±0.024 0.193±0.015＊0.470±0.024 p-JAK2 1.513±0.028 1.250±0.019 0.265±0.018＊0.943±0.024

3.3 细胞中MMP-2、MMP-9m RNA表达测定结果

与空白血清组比较，血府逐瘀汤含药血清组细胞中MMP-2、MMP-9mRNA表达显著减弱（P＜0.01），桃红四物汤含药血清组和抵挡汤含药血清组差异无统计学意义（P＞0.05），结果见表3。

表3 各组细胞中MMP-2、MMP-9m RNA表达测定结果（±s，n＝6）Tab 3 ResultsofMMP-2，MMP-9m RNA expressions in cellsofeach group（±s，n＝6）

表3 各组细胞中MMP-2、MMP-9m RNA表达测定结果（±s，n＝6）Tab 3 ResultsofMMP-2，MMP-9m RNA expressions in cellsofeach group（±s，n＝6）

注：与空白血清组比较，＊＊P＜0.01Note：vs.blank serum group，＊＊P＜0.01

组别空白血清组桃红四物汤含药血清组血府逐瘀汤含药血清组抵挡汤含药血清组MMP-9 1.000±0.000 0.719±0.071 0.544±0.029＊＊0.965±0.094 MMP-2 1.000±0.000 0.899±0.066 0.545±0.023＊＊0.924±0.099

4 讨论

中药血清药理学是利用含药血清代替中药复方而供实验研究使用的一种非单体药物药理研究的方法，使体外试验模拟了体内过程，达到了体外试验能够反映药物体内真实状态的目的，现此方法已被广泛用于抗肿瘤的研究中[7]。本研究选用3种不同的活血化瘀作用层次的经典中药复方，利用其含药血清从JAK/STAT信号通路磷酸化方面探讨了其抗神经胶质瘤细胞侵袭的可能机制。

STAT3通常以无活性的单体形式存在于细胞质中，当STAT被上游的JAK信号激活后，主要以活化的p-STAT形式进入细胞核内，刺激并导致某些与细胞侵袭密切相关的致癌基因异常表达，调节与癌细胞迁移和侵袭等相关的靶基因（MMP-2、MMP-9）转录活性[5]。MMP-2、MMP-9作为STAT3活化后引起迁移和侵袭的相关靶基因，是胶质瘤侵袭性预测的指标之一[8-9]。本研究结果显示，血府逐瘀汤含药血清干预U251细胞后，细胞侵袭能力显著降低，细胞中p-STAT3、p-JAK 2蛋白以及MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表达均显著减弱，而桃红四物汤含药血清和抵挡汤含药血清作用不明显。可见，血府逐瘀汤抑制U251细胞侵袭可能是通过抑制JAK2/STAT3信号通路的激活及下游侵袭相关靶基因MMP-2、MMP-9的表达而起作用。

综上，血府逐瘀汤可以作为一种JAK2/STAT3磷酸化的有效抑制剂进一步用于抗胶质瘤的研究，同时本研究也为开发一种新的抗肿瘤药物或药物前体提供了一定的参考依据。

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Effects of 3 Kinds of Serum Containning Blood-activating and Stasis-elim inating TCM Com pound Formulas on JAK/STAT Signal Pathway of Glioma U251 Cells

LIU Jianmin，HUANG Liangwen，ZHU Xuhong，HU Peng，YUAN Huaitao（Dept.of Neurosurgery，the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

OBJECTIVE：To evaluate the effects of 3 kinds of serum containing blood-activating and stasis-elim inating TCM compound formulas on aggressive behavior，Janus kinase（JAK）/signal transduction and transcriptional activator（STAT）pathway of glioma U251 cells.METHODS：Rats were random ly divided into normal saline group（5 m L/kg），Taohong Siwu decoction group（5.7 g/kg），Xuefu Zhuyu decoction（8.5 g/kg）and Didang decoction（2.8 g/kg），calculated by crude drug，intragastrically adm inistrated once a day，for 10 d.10%drug-containing serum culturemedium was prepared after 2 h of last adm inistration.A fter 10%drug-containing serum culturemedium intervening U251 cells for 1 week，Transwellmethod was conducted to detect the cell invasion rate，Western blot was adopted to detect the metal matrix protease 2（MMP-2），MMP-9，phosphorylated JAK2（p-JAK2），phosphorylated STAT3（p-STAT3）protein expression；and real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction method was used to detect MMP-2，MMP-9 mRNA expression.RESULTS：Compared w ith blank serum，Xuefu Zhuyu decoction drug-containing serum can reduce cell invasion rate（P＜0.05），decrease the MMP-2，MMP-9 mRNA and its protein expression，and p-JAK2，p-STAT3 protein expression in cells（P＜0.05 or P＜0.01），while there was no significant difference in above-mentioned indexes in Taohong Siwu decoction drug-containing serum group and Didang drug-containing serum group（P＞0.05）.CONCLUSIONS：In the 3 kinds of blood-activating and stasis-elim inating TCM compound formulas，Xuefu Zhuyu decoction shows significant invasive effect on inhibiting U251 cells；the mechanism may be related to inhibiting the activation of JAK2/STAT3 signal pathway and decreasing MMP-2，MMP-9 gene and protein expressions.

Blood-activating and stasis-elim inating；Invasion；Janus kinase/signal transduction and transcriptional activator pathway；Metalmatrix protease；Glioma U251 cells

R966；R285

A

1001-0408（2017）16-2176-04

国家自然科学基金资助项目（No.81072907）；广州市科技计划基金项目（No.201607010365）；广州中医药大学“高水平大学建设”项目（No.A1-AFD018171Z11072）

＊副教授，博士。研究方向：中西医结合神经肿瘤基础与临床研究。电话：020-36591396。E-mail：jm l_liu@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.04