AMD3100在大鼠短暂性局灶性脑缺血损伤超早期中的抗炎作用

袁淑绘+王聪聪+刘晓伟+宿振国

【摘要】 目的：探讨AMD3100在大鼠短暂性局灶性脑缺血损伤超早期的抗炎作用。方法：将雄性SD大鼠随机分为AMD3100处理组（AMD3100组）、溶剂对照组（PBS组）、假手术组，AMD3100组于再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）后给予AMD3100 PBS溶液腹腔注射，假手术组与PBS组于I/R后给予PBS溶液腹腔注射；各组线栓法复制120 min SD大鼠局灶性脑缺血模型，于I/R 24 h后使用ELISA法检测各组缺血区炎症因子IL-10、TNF-α、IL-1β含量。结果：AMD3100组较PBS组IL-10含量高，TNF-α、IL-1β含量低（P<0.05）。结论：AMD3100能够通过抗炎作用对大鼠短暂性局灶性脑缺血损伤起保护作用。

【关键词】 AMD3100； 短暂性局灶性缺血性脑损伤； IL-10； IL-1β； TNF-α

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.17.081 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2017）17-0154-03

The Anti-inflammatory Effect of AMD3100 on the Ultra-early Time of Transient Focal Brain Ischemic Injury in Rats/YUAN Shu-hui，WANG Cong-cong，LIU Xiao-wei，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2017，15（17）：154-156

【Abstract】 Objective：To explore the anti-inflammatory effect of AMD3100 on the ultra-early time of transient focal brain ischemic injury in rats.Method：Male SD rats were randomly divided into the AMD3100 group，Vehicle group（PBS group） and Sham group，AMD3100 group was given intraperitoneal injection of AMD3100 after ischemia-reperfusion（I/R），PDB group and Sham group were given of PBS after I/R.The transient focal brain ischemia model was induced by Zea-longa modified-suture middle cerebral artery occlusion（MCAO）.Inflammation factors IL-10，IL-1β，TNF-α were detected by using ELISA method.Result：The level of IL-10 was higher and the levels of IL-1β and TNF-α were lower in AMD 3100 group compared with the PBS group（P<0.05）.Conclusion：AMD3100 can improve the prognosis of cerebral ischemia by anti-inflammatory effect.

【Key words】 AMD3100； Transient focal ischemic brain injury； IL-10； IL-1β； TNF-α

First-authors address：Binzhou Medical University，Yantai 264003，China

缺血性卒中最重要的独立危险因素是短暂性局灶性脑缺血[1]，有文献[2]报道其后7 d内的脑梗死发生率可高达8%～10.5%，可导致严重的神经功能缺损甚至导致死亡。在短暂性局灶性脑缺血的发病过程中，在发病3～6 h（即超早期内）如果能够進行积极治疗，将可以大大降低后期发展为脑卒中风险[3]。前期笔者的研究“CXCLl2在大鼠短暂性局灶性脑缺血损伤超早期中的作用”表明AMD3100对大鼠短暂性局灶性脑缺血损伤具有保护作用[4]。本文将探讨AMD3100对大鼠短暂性局灶性脑缺血损伤的保护作用机制中的抗炎症作用，其他机制将在后续的研究中进行。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

清洁级成年SD雄性大鼠（200～220 g），购买于绿叶制药集团（中国烟台）。所有动物饲养在具有12/12 h，光照/黑暗循环（光8∶00-20∶00）的标准条件，食物和水充足。大鼠随机（单纯随机抽样法）分为AMD3100处理组（AMD3100组）、溶剂对照组（PBS组）、假手术组，每组各6只大鼠。除假手术组仅分离动脉外，其余两组均行MCAO手术。假手术组与PBS组于再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）后腹腔注射PBS溶液，AMD3100组给予腹腔注射AMD3100 PBS溶液，AMD3100给药浓度为5 mg/kg。

1.2 主要试剂与仪器

AMD3100（美国abcam公司）；IL-10、IL-1β、TNF-α、IL-6试剂盒（美国abcam公司）；722分光光度计（上海奥析科学仪器）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。

1.3 模型制备

SD大鼠短暂性局灶性脑缺血模型制作采用Zea-longa改良线栓法，步骤如下：雄性SD大鼠给予腹腔注射浓度为300 mg/kg的水合氯醛，大鼠取仰卧位，行颈部正中切口然后分离右侧颈外动脉（ECA）和颈总动脉（CCA）及颈内动脉（ICA），将ECA与CCA进行结扎，选择合适动脉夹夹闭ICA远心端，于CCA作斜形切口，将沾有肝素钠（2.4×106U/L）的尼龙线栓插入CCA，松开动脉夹，线栓经CCA分叉处进入ICA，顺ICA入脑至ACA，深度（18.5±0.5）mm，左侧大脑中动脉实现阻塞，2 h后拔出线栓然后将切口缝好，大脑中动脉实现再灌注。实现再灌注后，各组立即给予腹腔注射相应溶液。手术过程严格遵循无菌操作原则，整个过程将大鼠体温控制在37 ℃左右。使用Zea-longa建立的神经功能缺损程度的五级四分法对清醒大鼠的行为和神经症状进行评价，剔除不达标者。假手术组的线栓仅插入CCA，其余步骤同上。

1.4 ELIS檢测IL-10、IL-1β、TNF-α、IL-6的表达量

I/R 24 h后快速处死大鼠，在冰盘上分离右侧脑组织，取右侧大脑中动脉供血区域脑组织，距额叶前端3 mm和9 mm处进行冠状切割，取中间6 mm厚的脑组织块，再沿此脑块矢状缝左侧旁开2 mm处，由上至下切下，右侧部分即为右侧MAC供血区。将脑组织与适量PBS混匀，用组织均浆器将脑组织研磨匀浆，组织匀浆于3000 r/min离心20 min，取上清液至新的EP管中，根据说明书制作标准曲线，设空白孔和待测样本孔，然后每孔各加入40 μl的样品稀释液，待测样品孔加入10 μl待测样品，封板膜封板，37 ℃温箱恒温孵育30 min，洗液清洗5次，每次30 s，然后除空白孔外各孔均加入酶标试剂50 μl，37 ℃温箱恒温孵育30 min，洗液清洗5次，每次30 s。显色：每孔加入显色剂A和 B各50 μl，震荡混匀，37 ℃恒温避光显色15 min。终止：每孔各加入终止液50 μl终止反应（此时蓝色立转黄色）。测定：以空白孔调零，选择450 nm波长测量各孔的吸光度（OD值），根据标准曲线计算出各样本孔的浓度，进行统计学分析。

1.5 统计学处理

数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用F检验，两两比较用LSD法进行，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

用ELIAS试剂盒检测炎症因子IL-10、TNF-α、IL-1β的变化，结果显示：虽然各因子含量不同，但趋势基本相同。抗炎因子IL-10的含量，AMD3100组较PBS组高；促炎症因子TNF-α、IL-1β的含量，AMD3100组较PBS组低，见表1。

3 讨论

本研究表明：大鼠短暂性局灶性脑缺血损伤超早期应用AMD3100可以提高抗炎症因子IL-10的含量，降低促炎症因子IL-1β、TNF-α的含量。

AMD3100是CXCL12的受体拮抗剂，CXCL12是基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1），又称为前B细胞刺激因子（pre-B cell stimulatory factor，PBSF）。CXCL12有两种受体，分别是CXCR4 和CXCR7，其中CXCR7的表达有利于细胞生长、存活及黏附，活化的CXCR4的表达则有利于细胞增殖和迁移，AMD3100是CXCR4的特异性阻断剂[5]。趋化因子CXCL12及其CXCR4受体参与缺血再灌注后炎症反应，诱导细胞迁徙和归巢等生理病理过程，且与神经的产生、内分泌和变性等均有密切关系[6-8]。在缺血性脑卒中的不同时期CXCL12及其传导通路具有加重损伤及促进功能重建的双重作用[9]。笔者以往的研究结果表明在大鼠短暂性局灶性脑缺血损伤超早期，CXCL12主要是起加重损伤的作用，及早在超早期内应用CXCL12受体拮抗剂AMD3100，其可抑制CXCL12的活性，进而降低短暂性局灶性脑缺血损伤，改善脑缺血的症状及其预后，促进大脑功能的恢复[4]。在脑卒中动物模型中，星形胶质细胞和内皮细胞的CXCLI2表达上调[10]，CXCLI2的上调与缺血损伤区域单核细胞浸润有关，该研究提示CXCLI2参与卒中后的炎症病理过程[8]。CXCL12通过参与炎症反应可诱发及加重急性或延迟性细胞死亡，及早应用CXCL12受体拮抗剂AMD3100或许可阻断CXCL12参与的炎症反应，进而减轻脑损伤，这是笔者本次的研究内容。

笔者研究表明，超早期应用CXCL12受体拮抗剂AMD3100，能够阻断CXCL12参与的炎症反应，进而起到抗炎作用，在缺血损伤超早期内应用AMD3100能够使抗炎因子IL-10的含量增高，促炎症因子TNF-α、IL-1β的含量降低。IL-10对脑缺血损伤具有保护作用，是抗炎症因子，其保护作用机制可能是通过减少缺血后局部中性粒细胞浸润，进而减少神经元的凋亡而实现[11]。在缺血损伤超早期内应用AMD3100能够降低TNF-α的表达量，目前有研究表明TNF-α具有神经毒性，脑缺血损伤后TNF-α的含量增加[12]，TNF-α是促炎症因子，脑缺血损伤后，TNF-α可以诱导IL-1β等多种细胞因子释放，进一步加重炎性反应[13]，TNF-α还有一个重要作用就是可破坏血脑屏障导致外周白细胞浸润，引起脑水肿使脑缺血损伤进一步加重[14]。超早期内应用AMD3100能够降低IL-1β的表达量，IL-1β有加重脑损伤的作用，有研究表明IL-1β能够增大脑缺血的梗死灶体积，使用IL-1β受体拮抗剂不仅能够使脑缺血后梗死灶体积减小，而且使梗死灶周边神经元的存活数目增多[15]，笔者研究结果表明AMD3100能够减少IL-1β的含量，进而可减小梗死灶和减少神经元死亡数量，使脑缺血性损伤减轻。

综上所述，本研究的结果提示，在超早期内应用AMD3100能通过抗炎症作用使抗炎因子IL-10的含量增高；促炎症因子TNF-α、IL-1β的含量降低，进而对大鼠短暂性局灶性脑缺血损伤起保护作用，但本研究仅讨论了抗炎机制中IL-10、TNF-α、IL-1β炎症因子的变化，而其他炎症因子以及其他作用机制有待于进一步研究。

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